Тест-система для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени

Вирусы гриппа А широко распространены по всему миру, вызывая заболевание диких и домашних птиц, а также большинства видов млекопитающих и человека. Они отличаются крайне высокой степенью изменчивости их генома [5]. Классификация их подтипов основана на сочетании двух типов поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). Известно 16 подтипов гемагглютинина и 9 – нейраминидазы. От диких птиц, которые являются главными естественными резервуарами вирусов гриппа, изолированы возбудители со всеми известными комбинациями поверхностных белков [8].

На сегодняшний день высока вероятность возникновения пандемии среди людей, которая может быть вызвана вирусом гриппа А подтипа H5N1. В 1997 г. высокопатогенный вирус «птичьего гриппа» впервые выделили от человека во время вспышки болезни в Гонконге. Его обнаружили у 18 человек, контактировавших с домашними птицами [3, 4]. В 2003 г. в Гонконге во время очередной вспышки заболевания было инфицировано 5 человек, 2 из них умерли. Начиная с 2003 г. грипп птиц H5N1 отмечали во многих странах Азии, Африки, Ближнего Востока. На сегодняшний день в Индонезии зафиксировали 191 случай инфицирования людей вирусом «птичьего гриппа», 159 из них закончились смертельным исходом, а в Египте – 168 и 60 случаев соответственно [1]. В январе 2014 г. ВОЗ подтвердила случай заболевания гриппом, вызванный возбудителем подтипа H5N1, в Канаде у человека, приехавшего из Пекина. С 1997 г. на начало 2014 г. в мире зарегистрировано 649 случаев инфицирования людей «птичьим гриппом», 385 из них закончились летальным исходом [7]. Вирус гриппа А подтипа H5N1 также обнаружен в странах Европы, России, Казахстане [6]. Таким образом, существует необходимость быстрой идентификации его и постоянного мониторинга вирусов гриппа А у птиц, животных и человека.

В последние годы для диагностики вируса гриппа А стали широко использовать молекулярные методы. Наиболее известными и надежными из них являются методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) [2]. Особенность ПЦР-РВ заключается в возможности регистрации результата непосредственно в процессе реакции, в каждый момент времени, а основным преимуществом, по сравнению с классической ПЦР, – отсутствие стадии электрофореза, что позволяет снизить риск контаминации продуктами ПЦР и сократить время проведения анализа. Кроме того, ПЦР-РВ отличается высокой специфичностью реакции за счет использования специфичных зондов и возможностью создания мультиплексной (или множественной) тест-системы, позволяющей определять в одном образце несколько инфекционных агентов [2].

Цель наших экспериментов – разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени.

Материалы и методы. Для создания тест-системы использовали референтный штамм вируса гриппа А подтипа H5N1: A/Chicken/Kurgan/3/2005. РНК из вируссодержащей культуры клеток выделяли с помощью одноименного набора с неорганическим сорбентом (ООО «Ветбиохим»). 

Реакцию проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 10 ммоль Tris-HCl (pH 9,0); 50 ммоль KCl; 0,1% Triton X-100; 1,5 ммоль MgCl₂; 10 пмоль каждого праймера; 10 пмоль каждого зонда; 0,25 ммоль каждого  dNTP; 1,25 ед. Taq-полимеразы; 50 ед. MMLV-ревертазы; 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin; 5 мкл РНК. При постановке ПЦР-РВ и учете результатов применяли детектирующий амплификатор ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология»).

Результаты исследований. Для оптимизации условий проведения ПЦР-РВ на первом этапе нашей работы мы подобрали специфические праймеры и зонды, сопоставив 1196 нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина и 707 нуклеотидных последовательностей гена нейраминидазы вируса гриппа А подтипа H5N1 за период с 1991 до 2012 г., находящихся в банке данных NCBI. Далее создавали «консенсусные» последовательности для каждого подтипа генов гемагглютинина и нейраминидазы и сделали сравнительный компьютерный анализ между полученными последовательностями, в результате которого были выбраны наиболее консервативные участки генов HA и NA. К консервативным участкам гена HA подобрали 5 пар праймеров и 5 соответствующих им зондов. Затем из них выбрали пару праймеров 5F1532/5R1662 и зонд Probe 5, меченный HEX и BHQ1. Величина получаемого в результате амплификации фрагмента ДНК с использованием этой пары праймеров составила 130 пар оснований.

К консервативным участкам гена NA подобрали 4 пары специфических праймеров и 4 соответствующих им зонда. Из них выбрали пару праймеров 4F711N1/4R804N1 и зонд Probe 4N1, меченный FAM и BHQ1. Длина амплифицируемого фрагмента составила 93 пары оснований. Подобранные праймеры и зонды оптимизировали на вирусе гриппа А подтипа H5N1 A/Chicken/Kurgan/3/2005.

Для проведения ПЦР-РВ был установлен оптимальный температурно-временной режим (50 ⁰C – 30 мин; 94 ⁰C – 5 мин; 40 циклов: 94 ⁰C – 10 с, 55 ⁰C – 15 с, 72 ⁰C – 10 с; детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли при 55 ⁰C в течение 15 с).

Специфичность тест-системы проверяли, применяя панели контрольных образцов, представленных в таблице 1. С помощью разработанной мультиплексной тест-системы можно определять наличие РНК вируса гриппа А подтипа H5N1, а также дифференцировать его от других подтипов. Например, положительный сигнал регистрировали для вируса гриппа А подтипа H5N3 только по каналу HEX, а для РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 – по обоим.

Генно-инженерный положительный контроль создавали на основе штамма вируса гриппа A/Chicken/Kurgan/3/2005 (вирус гриппа А подтип H5N1). С него, как с матрицы, с помощью ранее подобранных праймеров амплифицировались фрагменты генов гемагглютинина и нейраминидазы, которые в дальнейшем клонировали в плазмиду pGEM-T Easy (Promega, США) согласно протоколу производителя. Конструирование рекомбинантной плазмиды подтверждали методом секвенирования. 

Для установления чувствительности разработанного положительного контроля готовили серию последовательных разведений (от 10^-1 до 10^-10) полученной плазмиды. Положительный сигнал зарегистрировали по каналам флуоресценции HEX (рис.1) и FAM (рис.2) для всех разведений, кроме 10^-10. Спектрофотометрическим методом контролировали массовую концентрацию плазмиды в разведении 10^-9. По результатам 6 измерений ее среднее значение составило 0,016 мкг/мл, что соответствует количеству ДНК 5×10³ копий/мкл.

Чувствительность разработанной тест-системы определяли с помощью штамма вируса гриппа А подтипа H5N1 VH5N1-PR8/CDC-RG с начальным титром 10⁷ ЭИД₅₀/мл. Штамм был любезно предоставлен Т.А. Тимофеевой  (ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи). Готовили серию последовательных разведений его до конечной концентрации 10^-6, которые затем проверяли методом ПЦР-РВ на наличие РНК вируса гриппа А подтипа H5N1. Предел обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа N1 (рис. 3) и вируса гриппа А подтипа H5 (рис. 4) составил 10³ ЭИД₅₀/мл.

Заключение. Разработана универсальная мультиплексная тест-система для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 на основе ПЦР в реальном времени. Она обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может быть рекомендована для лабораторной диагностики с целью выявления вируса гриппа А подтипа H5N1.

Таблица 1

Характеристика контрольных образцов, использованных для определения специфичности разработанной тест-системы

Литература

1. 1.ВОЗ: Глобальное предупреждение и ответные действия. Новости о вспышках болезней. 2013.
2. 2.Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Алипер Т. И. Молекулярная диагностика гриппа. Вестник Российской АМН. 2011; 5:28 – 34.
3. 3.CDC (1997). Isolation of Avian influenza A (H5N1) viruses from humans – Hong Kong. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. May – December 1997; 46:1204 – 1207.
4. 4.Claas E. C., de Jong J. C., van Beek R., Rimmelzwaan G. F., Osterhaus A. D. Human influenza virus A/HongKong/156/97 (H5N1) infection. Vaccine. 1998; 16:977, 978.
5. 5.World Health Organization. Avian influenza: assessing the pandemic threat. WHO, January, document 2005-WHO/CDS/2005; 29 available at http://whqlibdoc.who.int/hq/2005/WHO_CDS_2005.29.pdf.
6. 6.World Health Organization. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/ (H5N1) reported to WHO // 12 January 2007; available at http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2007_01_12/en/index.html.
7. 7.World Health Organization. Human infection with avian influenza A (H5N1) virus – update. Disease outbreak news. 9 January 2014, available at http://www.who.int/csr/don/2014_01_09_h5n1/en/.
8. 8.Zambon M. C. Epidemiology and pathogenesis of influenza. J. of Antimicrobial Chemotherapy. 1999; 44:3 – 9.