Изготовление и контроль качества сывороточных препаратов

Шемельков Евгений Владимирович, к.в.н., начальник отдела контроля качества, ООО «Ветбиохим».

Соболева Галина Леонидовна, лауреат Государственной премии РФ в области науки и техники, д.б.н., заместитель генерального директора по качеству, ООО «Ветбиохим».

Ключевые слова: гипериммунная сыворотка, иммуноглобулин, безвредность, антигенная активность, контроль качества. 

Общие сведения

Гипериммунные сыворотки и получаемые из них иммуноглобулины предназначены для создания пассивного антибактериального, антивирусного или антитоксического иммунитета у животных и/или человека. Действие таких препаратов начинается быстро — сразу после введения, однако срок действия ограничен периодом их полувыведения из организма, который для гетерологичных препаратов составляет 14-15 суток.

С момента получения первых гипериммунных сывороток (конец 19 века) до настоящего времени разработано значительное количество сывороточных препаратов и иммуноглобулинов, моно- и поливалентных, применяемых с лечебной и с диагностической целью, как в медицине, так и в ветеринарии. Современное сывороточное производство, как отрасль биологической промышленности, представляет собой сложный, длительный и многогранный технологический процесс, включающей в себя: работу со штаммами микроорганизмов, отбор и подготовку животных-продуцентов, выбраковку иммунологически ареактивных животных, кормление, содержание, разработку схем иммунизации, забор крови, получение готового продукта, различные виды контроля, как на стадии подготовки животных и получения сырья, так и готового лекарственного средства.

Не существует единых универсальных схем и методов получения сывороточных препаратов, применительно к разным видам антигенов. В каждом конкретном случае схемы иммунизации разрабатываются отдельно и определяются различием доз и методов введения антигена, количеством инъекций и интервалов между ними, объемом и кратностью забора крови. В компании ООО «Ветбиохим» с конца прошлого столетия ведется работа в данном направлении, результатом которой явилось создание и совершенствование следующих сывороточных препаратов для мелких домашних животных:

— сыворотка поливалентная против чумы плотоядных, парвовирусного, коронавирусного энтеритов и аденовирусных инфекций собак «ГИСКАН-5»;

— иммуноглобулин поливалентный против чумы плотоядных, парвовирусного, коронавирусного энтеритов и аденовирусных инфекций собак «ГЛОБКАН-5»;

— сыворотка гипериммунная против лептоспироза собак (содержит специфические антитела к лептоспирам серологических групп Canicola, Icterohaemorrhagiae и Grippotyphosa);

— глобулин против панлейкопении, инфекционного ринотрахеита, калицивироза и хламидиоза кошек «ГЛОБФЕЛ-4».

Технология производства.

На каждый препарат разработан и утвержден в установленном порядке технологический регламент в строгом соответствии, с которым, осуществляется изготовление каждой серии препарата.

Схематично производство сывороточных препаратов представлено на рисунке 1, на примере иммуноглобулина «ГЛОБКАН-5».

Работу со штаммами микроорганизмов проводят согласно СТО на каждый штамм. Так, например, процесс получения системы посевных материалов любого вируса включает следующие этапы:

— приготовление соответствующей культуры;

— проведение пассажей вируса;

— получение вирусной суспензии;

— промежуточный контроль штамма вируса;

— лиофилизация или замораживание штамма вируса;

— контроль штамма вируса.

Вирусы выращивают на соответствующих перевиваемых культурах клеток, лептоспиры культивируют на жидкой сывороточной среде реакторным методом, хламидии наращивают на куриных эмбрионах.

После культивирования и контроля качества антигены подвергают очистки и концентрированию, а затем из каждого антигена готовят моновакцину с добавлением адъюванта, в качестве которого мы используем синтетический полимерный адъювант нового поколения, обеспечивающий сочетание безвредности вакцины с высокой антигенной активностью.

 В качестве продуцентов, как принято во всём мире, мы используем клинически здоровых лошадей в возрасте от 2 до 15 лет, без признаков истощения, ожирения, переутомления, иммунологически реактивных, которым предварительно были проведены все вакцинации, обработки и диагностические исследования, согласно утвержденному плану противоэпизоотических мероприятий.

Перед каждым введением антигена производят измерение температуры тела лошади. Гипериммунизацию доноров проводят по соответствующим схемам, разработанным для каждого антигена.

Первое пробное взятие крови для определения уровня специфических антител к вводимому антигену осуществляют через 1,5-2 месяца после начала иммунизации. При достижении титра антител (для препаратов «Глобкан-5» и «Гискан-5») не ниже чем 1:512 в реакции нейтрализации (РН) для вируса чумы плотоядных, 1:256 для корона- и аденовирусов, 1:1024 в реакции торможения агглютинации (РТГА) для парвовируса собак у продуцентов начинают забор крови с целью получения гипериммунной сыворотки.

Эксплуатация животных-продуцентов предусматривает взятие крови по определенной схеме, при этом чередуют циклы иммунизации и крововзятия у животных-доноров с последующим предоставлением животным отдыха. Кровь берут только от лошадей с нормальной температурой тела.

Кровь от свертывания предохраняют добавлением антикоагулянта, затем ее подвергают сепарации для отделения форменных элементов, плазму крови дефибринируют. Полученную сыворотку крови консервируют и отстаивают в течение 60 суток при температуре 2-8ºС, после чего, ее подвергают каскадной фильтрации на нитроцеллюлозных фильтрах с диаметром пор от 1,2 до 0,22 мкм.

Сыворотку, полученную от одного животного в течение месяца, объединяют в один пул.

При изготовлении иммуноглобулинов из полученной сыворотки методом осаждения выделяют гамма-глобулиновые фракции белков, которые в дальнейшем смешивают исходя из активности каждого компонента. Полученный поливалентный полуфабрикат подвергают стерилизующей фильтрации, устанавливают уровень рН, после чего проводят промежуточный контроль по показателям стерильность и специфическая активность. В случае положительного результата контроля полуфабрикат разливают на автоматической линии в потребительскую тару. Отдел контроля качества присваивает препарату номер серии и делает отбор образцов согласно ГОСТ с целью:

— контроля качества готовой продукции по всем показателям, заложенным в нормативную документацию;

— закладки арбитражных проб в архив;

- проведения испытаний стабильности препарата в процессе хранения.

Если контроль проходит положительно по всем параметрам, заложенным в нормативную документацию (СТО), серию препарата снабжают соответствующим паспортом качества и выпускают в реализацию. Если препарат не проходит контроль, вся серия подвергается выбраковке и утилизируется.

Контроль качества на предприятии-изготовителе.

В процессе производства сывороточных препаратов отдел контроля качества осуществляет контроль на следующих этапах:

— контроль стерильности, специфичности и активности вирусных (бактериальных) антигенов;

— контроль уровня антител у доноров при гипериммунизации;

— входной контроль сывороточных полуфабрикатов (по показателям стерильность и уровень специфических антител) при получении однородного пула сыворотки;

— промежуточный контроль полуфабриката препарата (по показателям стерильность, уровень водородных ионов и специфических антител);

— контроль готового продукта.

При этом здесь не указаны контрольные мероприятия, относящиеся ко всему производству в целом, такие как: входной контроль сырья и материалов, контроль производственной среды, контроль качества дезинфекции и пр.

Контроль готового продукта.

Каждая серия готовой продукции проходит контроль согласно СТО на соответствующий препарат, по результатам которого специалисты отдела контроля качества ООО «Ветбиохим» оформляют паспорт качества на серию продукции, что является основанием для поступления лекарственного средства на склад и соответственно в продажу.

В таблице 1 представлен перечень показателей, по которым проводится контроль качества сывороточных препаратов.

Таблица 1.

 Показатели контроля готового сывороточного препарата 

* В препаратах «ГИСКАН-5» и «ГЛОБКАН-5» уровень специфических антител должен быть не ниже, чем:

— к вирусу чумы плотоядных – 1:128 (в РН),

— к парвовирусу собак – 1:128 (в РТГА),

— к коронавирусу собак – 1:64 (в РН),

— к аденовирусу собак – 1:32 (в РН). 

* В препарате «Глобфел-4» уровень специфических антител должен быть не ниже, чем:

— к вирусам панлейкопении, инфекционного ринотрахеита и калицивироза кошек – 1:32 (в РН),

-к хламидиям – 1:100 (в ИФА).

* В сыворотке гипериммунной против лептоспироза собак уровень специфических антител должен быть не ниже, чем 1:5000 (в РМА) к лептоспирам каждой серологической группы  (Canicola, Icterohaemorrhagiae и Grippotyphosa).

Как видно из таблицы 1, среди показателей качества отсутствует показатель определения количества белка в сыворотке крови. Общее количество белка в сыворотке крови не имеет коррелятивной связи со специфической активностью препарата, которую возможно оценить только в специализированных лабораториях, имеющих лицензию на работу со штаммами микроорганизмов, банк культуры клеток и штаммов микроорганизмов, а также штат специалистов соответствующей квалификации, аттестованных на работу со штаммами микроорганизмов.

Кроме того, на предприятии согласно требованиям ИСО 9001 разработана программа испытания стабильности каждого наименования продукции в процессе хранения, которая предусматривает дополнительный контроль препаратов по всем показателям качества, перечисленным в таблице 1, через определенные промежутки времени в течение и по окончанию срока годности препарата. Для иммунобиологических препаратов со сроком годности 2 года контроль стабильности в процессе хранения проводится по следующей схеме: первый год хранения – через каждые 3 месяца, второй год хранения — через каждые 6 месяцев. Полученные результаты контроля должны соответствовать требованиям нормативной документации, в противном случае серия препарата отзывается с реализации.

Контроль качества сторонними организациями (внешний контроль).

Помимо контроля качества, проводимого внутри организации-производителя, каждый препарат обязательно проходит испытания по всем показателям в сторонних организациях. В Российской Федерации все испытания препарат проходит в ФГБУ «ВГНКИ» (таблица 2), при регистрации за рубежом – в соответствующем контрольно-испытательном органе.   

Таблица 2.

Виды и периодичность внешнего контроля качества

По результатам проведения внешнего контроля:

— выдается (или не выдается) регистрационное удостоверение,

— подтверждается (или не подтверждается) сертификат качества (соответствия),

— подтверждается разрешение на реализацию препарата или препарат отзывается из продажи, включая розничные сети.

Следует отметить, что в РФ обязательными документами для производства, контроля и поступления препарата в торговую сеть являются наличие регистрационного удостоверения, сертификата соответствия и паспорта качества.

Сывороточные препараты, производимые ООО «Ветбиохим»: «ГИСКАН-5»; «ГЛОБКАН-5»; сыворотка гипериммунная против лептоспироза собак; «ГЛОБФЕЛ-4» являются высокоактивными препаратами, стабильность сохранения ими биологических свойств подтверждена неоднократными исследованиями.

Эффективность применения этих препаратов подтверждается стабильным объемом их производства и реализации, имеющим тенденцию к росту, рисунки 2, 3 и 4.