удобно купить

1580

19.06.2015

Эффективность иммунохроматографической тест-системы для быстрого выявления вируса африканской чумы свиней

Журнал Ветеринария №5, 2015 год

Проведена оценка эффективности иммунохроматографической тест-системы (ИХТС) «АЧС-ИХМ», предназначенной для быстрого одностадийного выявления вируса АЧС. Тест основан на использовании 2 разных моноклональных антител (МКА) к белку vр72 вируса АЧС, одно из них в форме конъюгата с коллоидным золотом (КЗ) нанесено на фиберглассовую мембрану, другое иммобилизовано на поверхности нитроцеллюлозной мембраны. Определена диагностическая чувствительность и специфичность ИХТС по сравнению с ИФА и ПЦР с использованием биологического материала от экспериментально зараженных и спонтанно инфицированных домашних свиней и диких кабанов. Показана 100% чувствительность и специфичность ИХТС при исследовании крови и селезенки от больных и павших от АЧС животных с высоким уровнем виремии. Установлено, что тест можно применять для выявления вируса АЧС в биоматериале в лабораторных и полевых условиях. 

Африканская чума свиней (АЧС) – высококонтагиозная болезнь домашних и диких свиней всех возрастов, возбудителем которой является ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae рода Asfivirus. С момента заноса вируса АЧС из Грузии на территорию Российской Федерации  (2007 г.), данное заболевание стало самой серьезной проблемой для отечественного свиноводства. За этот период в РФ сформировались две эндемичные по АЧС зоны, число неблагополучных пунктов продолжает расти. Распространению инфекции способствуют выносные вспышки АЧС, зарегистрированные в отдаленных от эндемичных по АЧС зон регионах, например, в Оренбургской, Ленинградской, Мурманской и Архангельской области. Это свидетельствует о том что, несмотря на принимаемые меры по нераспространению и искоренению болезни, АЧС в ближайшие годы будет продолжать наносить значительный экономический ущерб всей отрасли в целом и представлять большую угрозу продовольственной безопасности нашей страны [2, 4, 7]. 

Согласно стандартам Всемирной организации здравоохранения животных (OIE), диагностические исследования на АЧС должны быть направлены на идентификацию возбудителя (выделение и детекция вируса или геномной ДНК, тестирование вирусного антигена) и на выявление вирусспецифических антител [19]. При выборе тестов следует учитывать эпизоотическую обстановку в конкретном регионе, форму протекания болезни и вирулентность возбудителя. В нашей стране на сегодняшний день для выделения и детекции геномной ДНК вируса широко используют соответствующие тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе в режиме «реального времени» (РВ-ПЦР) производства ГНУ ВНИИВВиМ, ООО «Ветбиохим», ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. В последние годы в отечественных НИИ внедрен в практику комплекс современных методов диагностики АЧС [2, 4, 5]. 

Однако, учитывая серьезность проблемы, существует необходимость в разработке принципиально новых иммунохимических аналитических платформ, позволяющих с высокой чувствительностью регистрировать минимальные количества образовавшихся в результате реакции иммунных комплексов, а так же проводить исследования в полевых условиях и быстро принимать решения в неотложных или подозрительных случаях. Одним из них является иммунохроматографический метод (ИХМ), с помощью которого в течение нескольких минут можно визуально определить и оценить содержание антигенов, антител, и других диагностически важных белков в организме человека и животных. ИХМ – вариант гомогенного ИФА, проводят его на мембранном пористом носителе за счет латеральной диффузии реагентов. Метод прост при применении, подходит для быстрого и одностадийного выявления вирусного антигена или антител с использованием хроматографических мембран (иммунострипов) в качестве твердого носителя и иммобилизованных на них в разных зонах антител, одни из которых конъюгированы с КЗ [13, 15, 18]. На принципе ИХМ созданы лабораторные прототипы ИХТС для диагностики респираторно-репродуктивного синдрома свиней, блютанга, цирковирусной инфекции, бешенства и др. [10, 11, 12, 14]. Некоторые из них уже производят в виде коммерческих наборов для определения разных возбудителей и антител к ним [1, 6]. В медицине ИХТС используют для диагностики туберкулеза, хламидиоза, разных видов вирусных гепатитов, острого инфаркта миокарда и др. [3]. В 2013 г. в АНО «НИИ ДПБ» завершили разработку ИХТС на основе двух МКА к белку vp72 вируса АЧС, предназначенной для выявления вируса АЧС в биологическом материале инфицированных животных ( «АЧС-ИХМ»). Ранее с использованием этих же МКА была испытана тест-система в формате «сэндвич-ИФА» для установления антигена вируса АЧС [8]. В настоящее время на ее основе выпускают ИФА-набор ( «АЧС-ИФА», ООО «Ветбиохим»),  использующийся в ветеринарных лабораториях нашей страны для диагностических исследований на АЧС. Таким образом «сэндвич-ИФА» явился прототипом ИХТС, поскольку иммунологические принципы и основные специфические компоненты одинаковы для обоих методов.  

Цель нашей работы – сравнительная оценка эффективности ИХТС «АЧС-ИХМ» и других существующих методов диагностики АЧС. 

Материалы и методы. Специфические компоненты тест-системы «АЧС-ИХМ». В эксперименте использовали МКА #1vр72 и #2vр72 к белку р72 вируса АЧС, ранее полученные в нашей лаборатории [8]; а так же МКА из асцитных жидкостей, очищенные методом аффинной хроматографии на белок-А-агарозе (Sigma, США), для сорбции на мембрану и конъюгирования с КЗ. Конъюгат МКА с КЗ получали следующим образом: HAuCl4xH2O (Sigma, США) растворяли в горячей дистиллированной воде при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, доводя до кипения; после чего добавляли 1,667%-ный раствор цитрата натрия и перемешивали еще 5 мин; потом отключали нагрев и 18 ч перемешивали при комнатной температуре. Затем раствор фильтровали через ацетатный фильтр (0,2 микрона), доводили его до рН 9,0 – 9,3 1М карбонатным буфером, вносили раствор МКА #2vр72 и смесь, постоянно перемешивая, инкубировали 45 мин при комнатной температуре. Добавляли 1%-ный раствор ПЭГ-2000 и инкубировали 30 мин, продолжая перемешивать, при комнатной температуре. Продукт центрифугировали 20 мин при 8500g, удаляли супернатант и суспендировали осадок в минимальном количестве 5мМ карбонатного буфера+0,5 мг/мл ПЭГ-2000 (рН 9,0). Раствор фильтровали и хранили при 4 0С в темноте. 

МКА к IgG  мыши (Sigma, США) и специфические МКА #1vр72  ( «захватывающие») для нанесения соответственно на «контрольную» ) и на «тестовую» ) зону (рис. 1) готовили на 10 мМ фосфатном буфере с 3% метанола (рН 7,9). 

Компоненты для ИХТС «АЧС-ИХМ». Устройство ИХТС представлено на рисунке 1. Для подготовки подушек для нанесения образца и конъюгата материал разрезали на полоски шириной 25 мм и смачивали 0,5М Трис-буфером (рН 9,0), содержащим 1% БСА, 0,4% NP40, 0,05% NaN3 (или 50 мМ фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 0,5% поливинилалкоголь, 0,1% Тритон Х-100, 0, 5% БСА – для смачивания конъюгата). Высушивали в термостате 18 ч при 40 0С и хранили в сухой камере Dry keeper (Cole-Parmer, США) при 15% влажности. Обработанную подушку смачивали раствором конъюгата МКА с КЗ в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,9), содержащим 4% трегалозы и 50 мкг/мл БСА. Высушивали 3 ч в термостате при 40 0С и хранили в сухой камере Dry keeper (Cole-Parmer, США) при 15% влажности.

Для нанесения «захватывающих» и антивидовых антител в соответствующие зоны аналитической мембраны материал разрезали на полосы шириной 25 мм. Удаляли защитную бумагу с адгезивного слоя пластиковой основы и наклеивали аналитическую мембрану. МКА к IgG мыши (антивидовые) в 10 мМ фосфатном буфере с 3% метанола (рН 7,9) наносили с помощью прибора Linomat 5 (Швейцария) в «контрольную» ) зону (рис.1, зона С); а специфические МКА #1vр72 ( «захватывающие») в этом же буфере – в «тестовую» ) (рис.1, зона Т). 

При сборке изделия  последовательно наклеивали на адгезивный слой пластиковой основы полоски подушки конъюгата, подушки для нанесения образца и всасывающей подушки, как показано на рисунке 1. Полученный полуфабрикат разрезали поперёк на полоски (стрипы) шириной 0,5 см с помощью прибора Rotary Cutter (США) и помещали в специальные пластиковые футляры с отверстиями для внесения образца.

Испытуемую пробу (3 капли) пластиковой одноразовой пипеткой вносили в пробирку с 120 мкл ФСБТ, содержащего 0,5% БСА, тщательно перемешивали, затем этой же пипеткой 4 капли полученного материала вносили в зону S иммунострипа (рис.1). Реакцию учитывали в течение 20 мин, положительным считали результат, при выявлении двух окрашенных полосок – по одной в каждой из зон (C и T). При отсутствии в пробе антигена вируса АЧС видна только одна окрашенная полоса в контрольной зоне С.

Биоматериалом для изучения служили: культуральная жидкость, содержащая авирулентный штамм вируса АЧС; органы и кровь от животных после экспериментального заражения; пробы органов и крови больных и павших от АЧС особей. Из органов готовили 10%-ную суспензию в ФСБ, которую затем 10 мин центрифугировали при 1500 об/мин. Цельную кровь и ее сыворотку использовали без разведения. 

Для эксперимента отобрали 2-месячных подсвинков крупной белой породы средней упитанности из хозяйства, благополучного по африканской и классической чуме свиней. При их поступлении, затем после заражения и в продолжение всего опыта проводили клинический осмотр, термометрию, брали пробы крови для определения антител к вирусу АЧС методом ИФА. Масса тела животных составляла 20 – 25 кг,  до начала опыта их выдерживали 7 суток в карантине. Температура тела подсвинков колебалась в пределах 38,5 – 41,9 0С, а у двух особей она однократно опускалась до 38 0С. Заражали их вируссодержащим материалом в объёме по 2см3, который вводили в верхние дыхательные пути (животным первой группы по 5000 и второй – по 50 ГАдЕ). У подсвинков первой группы наличие гипертермии отмечали на 4 – 5-е сутки после заражения, а погибали они на 7 – 8-е сутки; второй – на 8 – 9-е и 14-е сутки соответственно. 

В качестве референтных способов определения вируса АЧС использовали методы, рекомендованные OIE, – РГАд, РПИФ, ПЦР. В сравнительных экспериментах применяли коммерческие ИФА- и ПЦР- наборы производства ГНУ ВНИИВВиМ и ООО «Ветбиохим».

Результаты исследований и обсуждение. Аналитическую чувствительность тест-системы определяли с помощью очищенного рекомбинантного белка vp72 в концентрации 2 мкг/мл и инактивированного культурального антигена, приготовленного из авирулентного штамма вируса АЧС. Оба препарата последовательно разводили ФБР с шагом 2 и параллельно исследовали двумя методами – ИФА и ИХТС. Полученные данные свидетельствовали о том, что по аналитической чувствительности ИХТС сопоставим с ИФА и позволяет выявлять культуральный антиген вируса АЧС в диапазоне разведений 1:10 – 1:320 (рис. 2). При использовании рекомбинантного белка vp72 аналитическая чувствительность ИФА и ИХТС составила 5 и 10 нг/мл соответственно.

Диагностическую чувствительность ИХМ сравнивали с таковой двух референтных методов диагностики АЧС. Для этого изучали сроки выявления возбудителя (вирусовыделение), фрагмента генома (ПЦР) и антигена (ИХМ) вируса АЧС в крови и секретах, взятых после экспериментального заражения животных вирулентным изолятом АЧС в динамике (табл. 1). 

Таблица 1

Результаты сравнительной оценки диагностической чувствительности ИХТС «АЧС-ИХМ»

Биоматериал

Вирусовыделение

ПЦР

ИХМ

Доза заражения животных, ГАдЕ                    

                                 

                              Срок выявления  (сутки

                                   после заражения)

Кровь

5000

1

50

3

5000

2

50

4

5000

5

50

7

Слюна

Н/и

Н/и

5000

   4

50

7

5000

7

50

9

Носовые смывы

Н/и

Н/и

5000

5

50

7

5000

7

50

10

Примечание. Н/и – не исследовали.

Как видно из представленных в таблице 1 данных, в зависимости от типа биологического материала и дозы введенного вируса, тест-система «АЧС-ИХМ» позволяет тестировать антиген вируса АЧС на 5 – 10-е сутки после заражения. Чувствительность ее при исследовании цельной крови составила 3,0 – 3,5 lg ГАдЕ50/см3.

После гибели или вынужденного убоя всех экспериментально зараженных подсвинков проверили наличие вируса АЧС в разных органах и тканях с помощью ИХМ, РПИФ/ПЦР и установили процент совпадаемости результатов этих реакций (табл. 2).  

Таблица 2

Результаты исследований по выявлению вируса АЧС разными методами

Биологический материал

Совпадаемость результатов ПЦР/РПИФ и «АЧС-ИХМ», %

Селезенка 

100

Лимфоузлы 

100

Почки 

100

Кровь

100

Экссудат из брюшной полости

100

Сыворотка крови

85,7

Легкие 

63,6

По данным этого и последующего опытов пришли к выводу, что наиболее подходящим биологическим материалом для проведения прижизненных исследований методом ИХТС является цельная кровь, а посмертных – селезенка (10% суспензия).  

Практическую эффективность тест-системы «АЧС-ИХМ» оценивали, используя разные образцы биологического материала от экспериментально зараженных и спонтанно инфицированных вирусом АЧС животных, с помощью одного или нескольких референтных методов в соответствии со стандартами OIE (РГАд, РПИФ, ПЦР). На первом этапе с помощью ИХТС «АЧС-ИХМ», а также ПЦР и РПИФ исследовали 48 проб биоматериала от домашних свиней и диких кабанов, из них 36 были взяты от животных с клиническими признаками АЧС, а 12 – от здоровых особей. Данные, которые получили при постановке этих реакций, свидетельствовали, что 36 проб являлись положительными, а 12 – отрицательными. Таким образом, совпадаемость результатов ИХТС с таковыми референтных методов составила 100%, то есть в практических условиях чувствительность и специфичность теста достигает 100%.

Аналогичные исследования провели в нескольких регионах России в лабораторных условиях, используя положительные и отрицательные пробы биологического материала, взятые от инфицированных и здоровых животных, предварительно охарактеризованных несколькими референтными методами (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика проб (n=82) исследованных ИХТС «АЧС-ИХМ» в практических условиях

Место проведения исследования

Биологический материал

Результат референтного метода

число положительных проб

число отрицательных проб

ФГБУ 

«ВНИИЗЖ»

Кровь, селезенка от инфицированных животных из очагов Тверской и Воронежской областей (n=25)

20

5

Волгоградская областная ветеринарная лаборатория

Кровь, селезенка, костный мозг, лимфоузлы, легкое, почка (n=48)

37

11

ФГБУ «Тверская МВЛ»

Селезенка диких кабанов (n=9)

4

5

Исследования показали, что все положительные (n=61) и отрицательные (n=21) в ПЦР и РПИФ пробы дали аналогичный результат и в ИХТС «АЧС-ИХМ». На основании проведенных экспериментов сделали вывод, что ИХТС «АЧС-ИХМ» эффективна при тестировании биоматериала с максимально высоким содержанием вируса АЧС. Это заключение подтвердили при изучении проб, полученных от животных свиноводческого хозяйства промышленного типа при вспышке АЧС (рис. 3). При исследовании биоматериала от инфицированных животных в этом же хозяйстве получили положительные результаты в ИХТС «АЧС-ИХМ» и при параллельном тестировании их в референтных лабораториях, что позволило нам поставить окончательный диагноз на АЧС. В настоящей работе впервые в РФ сделана сравнительная оценка эффективности разработанной ИХТС для выявления вируса АЧС. В качестве основных компонентов тест-системы применяли высокоспецифичные МКА, что обеспечило аналитическую чувствительность ИХТС, сопоставимую с чувствительностью ИФА. 

При исследовании биоматериала от экспериментально зараженных животных в динамике, диагностическая чувствительность ИХМ оказалась предсказуемо ниже по сравнению с референтными методами, это снижает его потенциал, как средства ранней диагностики АЧС. Однако, при изучении биологического материала от больных и павших животных с высоким уровнем виремии, характерным для острой формы АЧС, чувствительность и специфичность ИХТС «АЧС-ИХМ» по сравнению с ПЦР и РПИФ составила 100%. Следовательно, ИХТС можно использовать в ветеринарной практике для быстрого выявления вируса АЧС во время вспышек заболевания в качестве первичного и оперативного метода диагностики. Важнейшим его преимуществом является простота и быстрое получение результатов без применения специального оборудования, как в лабораторных, так и в полевых условиях. При необходимости можно пользоваться специальными анализаторами, позволяющими инструментально учитывать, сохранять и обрабатывать результаты, что важно при проведении массовых исследований [13]. Следует отметить, что ИХМ нельзя считать альтернативой другим методам диагностики АЧС и его результаты не являются окончательными при постановке диагноза на АЧС. Его задача – предварять референтные анализы и указывать на необходимость их проведения, если данные ИХМ положительные или сомнительные. Поэтому, для постановки окончательного диагноза на АЧС следует обязательно использовать референтные методы в соответствии с рекомендациями OIE [19]. 

Заключение. Показана высокая эффективность ИХТС «АЧС-ИХМ» в качестве первичного теста при обследовании животных с клиническими признаками болезни неясной этиологии и при подозрении на АЧС. В практических условиях тест обладает необходимой чувствительностью и специфичностью, поэтому его можно использовать для экспресс-диагностики АЧС. 

Литература

1. Верховский О. А., Слугин И. В. Тест-система «Парвокан»: высокоэффективный экспресс-метод диагностики парвовирусного энтерита собак. Ветеринария. 1999; 10: 51, 52.

2. Гребенникова Т. В.,.Забережный А.Д, Алипер Т. И., Верховский О. А., Непоклонов Е. А. Диагностика африканской чумы свиней в Российской Федерации. Вопросы вирусологии. 2013; 1: 64 – 79.

3. Зырянова А. В., Ярохно Н. Н., Николаев К. Ю. Эффективность иммунохроматографического метода определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, при ранней дифференциальной диагностике острого коронарного синдрома. Патология кровообращения и кардиохирургия.  2010. 4: 12 – 16.

4. Куринов В. В., Васильев А. П., Белянин С. А., Стрижакова О. М., Ногина И. В., Сидлик М. В., Газаев И. Х., Цибанов С. Ж., Миронова Л. П., Аликова Г. А., Джаилиди Г. А., Черных О. Ю. Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы. Ветеринария Кубани. 2014; 3: 5 – 9.

5. Латышев О. Е., Елисеева О. В., Гребенникова Т. В., Верховский О. А., Цибезов В. В., Черных О. Ю., Джаилиди Г. А., Алипер Т. И. Тест-система на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения африканской чумы свиней. Вопросы вирусологии. 2014; 5 (59: 47 – 49.

6. Панюшкин А. И. Апробация иммунохроматографических тестов для диагностики вирусного трансмиссивного гастроэнтерита, эпизоотической диареи и ротавирусной инфекции свиней. Ветеринария. 2013; 11:16 – 19.

7. Хоменко С., Бельтран — Алкрудо Д., Розстальный А., Пинто Х., Луброт Х., Мартен В., Гогин А., Колбасов Д. Африканская чума свиней в Российской Федерации: факторы риска для Европы и стран за ее пределами. Ветеринария. 2013; 10: 3 – 16.

8. Цибезов В. В., Терехова Ю. О., Баландина М. В., Латышев О. Е., Гребенникова Т. В., Верховский О. А., Алипер Т. И., Шевкопляс В. Н. Разработка иммуноферментных методов диагностики африканской чумы свиней. Ветеринария Кубани. 2012; 1: 20 – 24.

9. Costard S., Wieland B., de Glanville W., Jori F., Rowlands R., Vosloo W., Roger F., Pfeiffer D., Dixon L. African swine fever: how can global spread be prevented? Phil. Trans. R. Soc. 2009; B 364:2683 – 2696.

10. Cui S., Zhou S., Chen C., Qi T., Zhang C., Oh J. A simple and rapid immunochromatographic strip test for detecting antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Virol. Methods. 2008; 152 (1 – 2):38 – 42. 

11. Fu B. Q., Li W. H., Gai W. Y., Yao J. X., Qu Z. G., Xie Z. Z., Wang Y. H., Zhang D. L., Blaga R. Detection of anti-Trichinella antibodies in serum of experimentally-infected swine by immunochromatographic strip. Vet. Parasitol. 2013; 194 (2 – 4):125 – 127. 

12. Jin Q., Yang J., Lu Q., Guo J., Deng R., Wang Y., Wang S., Wang S., Chen W., Zhi Y., Wang L., Yang S., Zhang G. Development of an immunochromatographic strip for the detection of antibodies against Porcine circovirus-2. J. Vet. Diagn. Invest. 2012; 24 (6):1151 – 1157.

13. Von Lode P. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 2005; 38 (7):591 – 606.

14. Nishizono A., Khawplod P., Ahmed K., Goto K., Shiota S., Mifune K., Yasui T., Takayama K., Kobayashi Y., Mannen K., Tepsumethanon V., Mitmoonpitak C., Inoue S., Morimoto K. A simple and rapid immunochromatographic test kit for rabies diagnosis. Microbiol. Immunol. 2008; 52 (4):243 – 249. 

15. Paek S. H., Lee S. H., Cho J. H., Kim Y. S. Development of rapid one-step immunochromatographic assay. Methods. 2000; 22 (1):53 – 60.

16. Sánchez-Vizcaíno J.M. African swine fever. In: Diseases of Swine, 9th Edition. Ed:. A.D. Leman, B.E. Straw, W.L. Mengeling, S. Dallaire, D.J. Taylor. Iowa State University Press, Ames (Iowa, USA). 2006; 93 – 102.

17. Yang J., Hua Q., Chen H., Lv J., Qin Z., Jin M., Tao H., Zeng S., Ruan Z., Chen B., Zhou X. J. Development and evaluation of an immunochromatographic strip for the detection of serum antibodies against bluetongue virus. Virol Methods. 2010; 163 (1):68 – 73. 

18. Wong R. C., Tse H. Y. (Eds.) Lateral Flow Immunoassay. N.Y. Humana Press, 2009; 224 р.

19. World Organization of Animal Health (OIE). African swine fever. Manual of Standards for diagnostic test and vaccines, 2012.