Сравнительный анализ факторов формирования антирабического иммунитета у мелких домашних животных

Ирина Владимировна Непоклонова, к.в.н., зав. отделом диагностики, терапии и профилактики инфекционных болезней, nepoklonova@rosvet.ru

Милана Анатольевна Лосич, к.б.н., научный сотрудник, zxbuabivpu@enzoyre.eh

Ольга Николаевна Зайкова, младший научный сотрудник, mnlxbin_b_a@znvy.eh

Олег Анатольевич Верховский, д.б.н., профессор, президент, vasb@qcev.eh

Тарас Иванович Алипер, д.б.н., профессор, руководитель лаборатории, nyvcre@aneinp.pbz

АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», Москва, 8 (499) 190-75-61, www.dpri.ru

Проведен сравнительный анализ уровня антирабических антител в сыворотках крови мелких домашних животных после вакцинации против бешенства. В данной статье отражён современный подход при оценке напряжённости поствакцинального антирабического иммунитета у мелких домашних животных и зависимости титра вируснейтрализующих антител от вида, возраста, породы и кратности вакцинации.

Методом флюоресцирующих вируснейтрализующих антител (FAVN) был количественно определён уровень антирабических антител в 1003 сыворотках крови от животных, а именно 698 собак (более 89 пород), 305 кошек (26 пород), 4 хорька и одну шиншиллу. При исследовании сывороток крови собак выявлено, что титр антител, не достигающий защитного уровня 0,50 МЕ\мл (OIE, WHO), был у 88 животных, что соответствует 12,6% от общего числа образцов сывороток крови собак. При исследовании сывороток крови кошек показано, что уровень антирабических антител достигает значений не ниже защитного уровня после однократной иммунизации и в возрасте животного до 1 года не зависимо от породы (98,4%).

Выявлено, что у собак одной породы и одного возраста даже после 1-, 2- или 3-х кратной вакцинации не всегда вырабатываются защитные антитела в титре ≥ 0,50 МЕ\мл.

Ключевые слова: бешенство, антирабический иммунитет, защитный титр антител к вирусу бешенства

Comparative analysis  OF FORMATION OF ANTI-RABIES IMMUNE RESPONSE IN PETS

I.V. Nepoklonova, M.A. Losich, O.N. Zaykova, O.A. Verkhovsky, T.I. Aliper

Diagnostic and Prevention Research Institute (DPRI), Moscow, 8 (499) 190-75-61, www.dpri.ru

A comparative analysis of the level of rabies antibodies in the sera of pets after vaccination against rabies. In this article, a modern approach is reflected in estimating the intensity of post-vaccination anti-rabies immune response in pets and rabies antibody level depending on the species, age, breed, and the multiplicity of vaccination.

By use of the fluorescent antibody virus neutralizing test (FAVN) the level of anti-rabies antibodies in 1003 sera from animals, which included more than 698 dogs (89 breeds of dogs), 305 cats (26 species of cats), 4 ferret and a 1chinchilla was quantitated. The study of the sera from dogs revealed that the antibody titer, under the protective level of 0.50 IU \ ml (OIE, WHO), was 88 animals, which corresponds to 12,6% of the total blood serum samples of dogs. The study of blood serum of cats it showed that the level of anti- rabies antibodies reaches a protective level even after a single immunization in the animal up to 1 year of age, regardless of the breed (98,6%).

We have shown that in dogs of the same breed and age group the protective antibodies do not always reach the level of 0.50 IU/ml even upon 1-,2-,fold or multiple vaccination.

Key words: rabies, anti- rabies immunity, protective titer of antibody against rabies

Бешенство – широко распространенная в мире острая зоонозная нейроин­фекция, возбудителем которой является РНК-содержащий вирус, относя­щийся к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavi­rus и являющийся единственным из царства Virae, поражающим всех тепло­кровных животных, в т.ч. человека со 100% летальностью. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший социальный и экономический ущерб [2].

Вирус бешенства, в основном, поддерживается в рамках двух взаимопроникаю­щих экологических циклов: городское бешенство – чаще всего обнаруживается у собак и кошек и элиминируется в ходе программ вакци­нации; бешенство в дикой природе – имеет широчайшее распростране­ние среди разных видов животных (рыжие и бурые лисы, песцы, еноты, енотовид­ные собаки, волки, барсуки, скунсы и летучие мыши). Этот цикл мо­жет быть значительно уменьшен при помощи вакцинации с использованием приманок, содержащих вакцину, которые разбрасываются в местах обита­ниях животных [7]. В Российской Федерации эпидемиологическая ситуация по бешенству остается неблагополучной несмотря на имеющуюся систему профилактических и экстренных мер, включающих в себя оральную вакцина­цию диких плотоядных животных, повсеместную вакцинацию собак и кошек, а также использование комплекса лабораторных диагностических методов, предписанных ВОЗ и Всемирной ор­ганизацией по охране здоровья животных (OIE). Так, по данным Россельхознадзора, в первом квартале 2016 г зарегистрировано 634 неблагополучных по бешенству пунктов, в которых заболело и пало 718 животных; во втором квартале 2016 г зафиксировано 490 очагов бешенства, заболело и пало 551 животное; в третьем квартале 2016 выявлено 405 неблагополучных пунктов, в которых заболело и пало 436 животных, 53% которых – дикие животные, 39% — домашние плотоядные и 8% — сельскохозяйственные животные. Наибольшее число неблагополучных пунктов за 9 месяцев 2016 года зарегистрировано в Московской области [1].

Согласно рекомендациям ВОЗ и МЭБ, защитный уровень вируснейтрализующих антител у млекопитающих равен 0,50 МЕ/мл. Для вакцинации домашних животных используются отечественные и зарубежные инактивированные антирабические вакцины, являющиеся единственным эффективным средством специфической профилактики бешенства. Одним из показателей эффективности применяемых вакцин является уровень вируснейтрализующих антител, определяемый в сыворотке крови животных (уровень популяционного антирабического иммунитета) [6,8].

Согласно последним рекомендациям WSAVA, в неблагополучных по бешенству территориях рекомендуют вакцинировать щенков на 1-и году жизни в возрасте 12 недель и повторно — через 2-4 недели после первой вакцинации. Ревакцинацию у собак рекомендуют проводить через 1 год. У кошек, в силу особенностей формирования видового антирабического иммунитета, WSAVA рекомендует проводить однократную вакцинацию в возрасте 12 недель и ревакцинацию через 1 год [17].

На данный момент существуют тенденции к сокращению кратности вакцинации против бешенства у животных старше 1 года. Но, с увеличением действия сроков ревакцинации от 1 года до 3-х лет, не всегда у животных вырабатываются защитные антитела против вируса бешенства.

 В настоящее время существуют следующие методы оценки уровня антирабических антител, рекомендованные ВОЗ: FAVN (флуоресцентный вируснейтрализующий тест), RFFIT (тест быстрого торможения фокуса флюоресценции) и ELISA (ИФА- иммуноферментный анализ, применяется для мониторинга титра антител после кампании по оральной вакцинации) [2,9,15,16].

На протяжении 10 лет наша лаборатория успешно проходит аккредитацию в референтном центре по бешенству OIE Nancy Laboratory for Rabies and Wildlife ANSES (г. Нанси, Франция), что даёт возможность проводить исследования современными методами, направленными как на определение уровня антирабических вируснейтрализующих антител у животных, так и на выявление самого вируса.

Известны факторы, влияющие на формирование антирабического иммунитета у собак и кошек, к которым относятся индивидуальные особенности иммунной системы животного, вид, порода, возраст, а также кратность вакцинации против бешенства [5,10]. Однако, исследований в этом направлении, результаты которых были бы представлены в отечественной и зарубежной литературе, крайне мало. В этой связи целью настоящей работы являлось обоб­щение результатов многолетних исследований авторов по оценке факторов, влияющих на напряженно­сть антирабического иммунитета и некоторых тенденций его формирования у различных пород собак и кошек. 

Материалы и методы

Работа была проведена в 2006 — 2016 гг. в процессе которой были исследованы 1003 сыворотки крови от животных после одно-, дву-, и многократной вакцинации против бешенства. В исследованиях было задействовано 89 пород собак (698 животных), 26 пород кошек (305 животных), 4 хорька и 1 шиншилла. Определение титра антирабических антител проводили методом флуоресцентных вируснейтрализующих антител (FAVN тест), согласно рекомендациям OIE [16]. Для постановки реакции использовали вирус бешенства штамм CVS-11, линию клеток BHK-21/клон 13, стандартный препарат ВОЗ, содержащий антирабические антитела в концентрации 0,50 МЕ\мл (International laboratory for biological standards, Copenhagen, Denmark: second international standard for rabies immunoglobulin). В качестве конъюгата использовали моноклональный ФИТЦ-иммуноглобулин (Fujirebio, США). Учёт реакции проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus CKX41 (Япония).

Подсчет титра антител проводили по формуле Spearman-Kãrber:

log₁₀ (конечное разведение) = — (x 0 — Σ)

х0 = — (log₁₀ последнего разведения со всеми положительными лунками)

d = log₁₀ этапа разведения, один в данном случае

ni = количество воспроизведений, шесть в данном случае

ri = количество положительных лунок.

 Статистическую обработку ре­зультатов проводили общепринятыми ме­тодами с использованием компь­ютерных программ Microsoft Office Excel 2007, Stat Plus 2005. Значения критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.

Результаты исследований и обсуждение

Известно, что на формирование противовирусного иммунитета помимо иммуногенности вакцины и биологических особенностей самого возбудителя, большое влияние оказывают индивидуальные особенности организма животного, его вид, пол, возраст, порода и общее состояние здоровья. Как показывает опыт, уровень иммунного ответа на введение одной и той же вакцины не одинаков у разных животных [5]. Результаты исследования сывороток крови собак приведены в таблице 1. При этом некоторые породы были объединены в одну группу на основании общих фенотипических признаков. Следует отметить, что по международной статистике именно укусы бешеных собак являются причиной 98% случаев заражения и гибели от бешенства людей [3].

Таблица 1

Уровень вируснейтрализующих антирабических антител в сыворотках крови собак разных пород

Кроме того были проанализированы результаты FAVN у тех пород собак, где количество объектов исследования не превышало двух в каждой породе

Как видно из представленных результатов, установлена статистически достоверная зависимость величины уровня антирабических антител от кратности вакцинации. При этом формирование антирабического поствакцинального иммунного ответа происходит неодинаково у разных пород и в зависимости от возраста животного. Так, уровень антител не достигал протективного значения у 88 собак (12,6%), из которых 76,1% (n=67) приходится на животных, вакцинированных однократно на момент исследования, и 65,9% — на животных в возрасте до 1 года (n=58). У собак смешанных пород, а также у собак породы Пудель, Китайская хохлатая и Джек Рассел даже после однократной иммунизации зафиксирован выраженный иммунный ответ (титр антирабических антител ≥ 0,50 МЕ\мл), у собак породы Чихуахуа всего в 5% случаев наблюдали титр антирабических антител, не достигающий порогового. В то же время у некоторых декоративных (шпиц), экзотических пород собак, а также золотистых ретриверов (лабрадор) и овчарок титр антирабических антител даже после многократной вакцинации не достигал протективного значения.

Результаты исследований зарубежных авторов свидетельствуют о том, что у собак моложе 1 года вероятнее всего будет низкий уровень антирабических антител, в отличие от годовалых. Это связывают с наличием в организме этих животных колостральных антител, которые даже в низких титрах могут препятствовать формированию напряженного иммунитета. После проведения повторной вакцинации у этих животных наблюдали необходимый уровень антирабических антител [3,12]. Таким образом, наши результаты полностью совпадают с результатами исследований французских учёных [8,12,13] и свидетельствуют о том, что двукратная вакцинация собак на первом году жизни обоснована.

По данным шведских учёных было продемонстрировано, что, помимо породы, на уровень антирабических антител влияет размер собак, при этом у собак мелких пород его значения достоверно выше [11]. В наших исследованиях не была установлена зависимость уровня антирабических антител от веса и размера животного, но отмечено, что у разных пород его поствакцинальные показатели могут достоверно отличаться.

Наши результаты не дали однозначного ответа на вопрос о влиянии возраста животных на антирабический иммунный ответ. В одних случаях этот фактор оказывал супрессивное влияние на иммунитет, в других – нет. Вместе с тем одно исследование, проведенное на старшей возрастной группе животных показало, что при регулярной вакцинации против бешенства у них зафиксирован даже более высокий уровень антирабических антител, чем у молодых особей [3].

Результаты исследований сывороток крови кошек приведены в табл. 2, результаты FAVN у тех пород кошек, где количество объектов исследования не превышало двух в каждой породе

Таблица 2

Уровень вируснейтрализующих антирабических антител в сыворотках крови кошек разных пород

 Анализ полученных результатов показал, что в отличие от собак только у 5-ти кошек из 305 (1,6%) уровень антирабических антител не достигал протективного показателя. Во всех 5-ти случаях животные находились в возрасте до 1 года и были однократно привиты на момент исследования. Следует отметить, что содержание антирабических антител ниже порогового уровня наблюдали только в трех породах кошек: Курильский бобтейл (1 животное из 5), Ангора (1из 2-х), Саванна (2 из 2) и Британская короткошёрстная (1 из 26). Во всех остальных случаях мы зафиксировали высокие значения титра антител у кошек даже при однократной иммунизации в возрасте до 1 года. Сравнительный анализ полученных результатов по двум видам домашних животных свидетельствует о положительной корреляции между уровнем антирабических антител и кратностью вакцинации, при этом абсолютные величины показателей были достоверно выше у кошек.

Таким образом, из представленных данных видно, что у кошек, в отличие от собак, в подавляющем большинстве случаев, уровень антирабических антител достигает высоких значений даже при однократной вакцинации животных вне зависимости от возраста и породы. При этом интересным является тот факт (рис.3), что у них после многократной вакцинации наблюдается незначительное снижение уровня антирабических антител.

Влияние кастрации на антирабический иммунный ответ до конца не изучено. По некоторым сведениям у некастрированных котов титры антирабических антител ниже, чем у кастрированных, что объясняется деятельностью гонодальных стероидных гормонов и их влиянием на продукцию цитокинов [4]. В нашей работе не было отмечено существенной разницы между формированием антирабического иммунного ответа у кастрированных и некастрированных животных, что впрочем, связано с отсутствием документированных данных о проделанной операции.

Дополнительно были получены данные исследований сывороток крови небольшой группы других видов мелких домашних животных. Установлено, что у хорьков (n=4) среднегеометрический уровень антирабических антител составил 3,02 МЕ\мл, при этом их значение меньше протективного показателя было обнаружено у одного животного в возрасте до 2-х лет после однократной иммунизации. У шиншиллы содержание антирабических антител составило 10,45 МЕ\мл после многократной вакцинации.

Полученные нами результаты вполне согласуются с результатами европейских исследователей. Так, в Швеции и Японии были проведены исследования уровня антирабических антител у собак разных пород после вакцинации различными вакцинами против бешенства. Было установлено, что антирабический иммунный ответ у собак зависит от типа используемой вакцины, кратности вакцинации, породы, возраста, в котором была впервые вакцинирована собака, и количества дней после вакцинации на момент исследования [11,14].

Заключение

Проведенные исследования по оценке факторов, влияющих на формирование антирабического иммунитета у мелких домашних животных, позволило определить ряд закономерностей. Во-первых, установлена прямая зависимость уровня антирабических антител в сыворотках крови собак и кошек от кратности вакцинации. Во-вторых, у собак существуют породные особенности, оказывающие влияние на уровень антирабических антител, который неодинаков при сопоставимых условиях содержания животных и использовании аналогичных вакцин. И, в-третьих, в отличие от собак, у подавляющего большинства кошек (98,4%) даже после однократной иммунизации (в том числе, у животных в возрасте до 1 года) содержание антирабических антител превышало протективный показатель. 

Приведенные факторы, оказываю­щие влияние на формирование антирабического иммунитета, должны учиты­ваться при вакцинации собак и кошек, для чего рекомендуется проводить оценку содержания вируснейтрализующих антител у всех вакцинированных животных, особенно из не­благополучных по бешенству территорий.

Литература

1. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. Россельхознадзор. Available at:www.fsvps.ru.
2. Всемирная организация здравоохранения. Availableat: http://www.who.int/ru
3. Орлова С. Т., СидорчукА.А., Новый взгляд на поствакцинальный иммунитет у собак и кошек. Часть 2. Анализ данных, полученных в экспериментах по попределению длительности иммунитета у собак.// Российский ветеринарный журнал, МДЖ, №1, 2016. – С.18-20
4. Орлова С. Т., СидорчукА.А., Новый взгляд на поствакцинальный иммунитет у собак и кошек. Часть 3. Анализ данных, полученных в экспериментах по попределению длительности иммунитета у кошек.// Российский ветеринарный журнал, МДЖ, №2, 2016. – С.43-44
5. Орлянкин Б. Г., Непоклонов Е. А., Алипер Т. И.,// Основы противовирусного иммунитета// Москва, 2011 г.,с.17-20,66-78.
6. Сергеев В. А., Непоклонов Е. А., Алипер Т. И. // Вирусы и вирусные вакцины/. Москва,2007г. с.48-75.
7. Шабейкин А. А., Гулюкин А. М., Зайкова О. Н., Обзор эпизоотической ситуации по бешенству в Российской Федерации за период с 1991 по 2015 годы/Ветеринария Кубани, №4 2016
8. Cliquet F., Aubert M. & Sagne L. (1998). Development of a fluorescent antibody virus neutralization test (FAVN test) for the quantification of rabies-neutralising antibody. Immunol. Methods, 212, 79-87.
9. Cliquet F., Sagne L., Schereffer J. L. & Aubert M. F.A. (2000). ELISA tests for rabies antibody titration in orally vaccinated foxes sampled in the fields. Vaccine, 18, 3272-3279.
10. Losich Milana, Aliper T. I./ Analysis of vaccine-induced antirabic humoral immunity in carnivores (dogs, cats and grey foxes)./ Rabies serology meeting, Nansy, Franse, 2013.
11. Louise T Berndtsson, Ann-Kristin J Nyman, Esteban Rivera, Berndt Klingeborn, Factors associated with the success of rabiesvaccination of dogs in Sweden//ActaVeterinariaScandinavica 2011, 53:22
12. Mauti S, Traoré A, Hattendorf J, Schelling E, Wasniewski M, Schereffer JL, Zinsstag J, Cliquet F,Factors associated with dog rabies immunisation status in Bamako, Mali//Acta Trop.2015 Dec 12. pii: S0001-706X (15)30139-X.
13. Minke JM, Bouvet J, Cliquet F, Wasniewski M, Guiot AL, Lemaitre L, Cariou C, Cozette V, Vergne L, Guigal PM, Comparison of antibody responses after vaccination with two inactivated rabies vaccines//Vet Microbiol,2009 Jan 13;133 (3):283-6
14. Rikiya Shiraishi, Masaaki Nishimura, Ryuji Nakashima, ChihoEnta and Norio Hirayama, Neutralizing Antibody Response in Dogs and Cats Inoculated with Commercial Inactivated Rabies Vaccines// Vet. Med. Sci. 76 (4): 605–609, 2014
15. Wasniewski M, Labbe A, Tribout L, Rieder J, Labadie A, Schereffer JL, Cliquet F, Evaluation of a rabies ELISA as an alternative method to seroneutralisation tests in the context of international trade of domestic carnivores//J Virol Methods.2014 Jan;195:211-20
16. World Organization of Animal Health, Manual, 2008
17. WSAVA Global Veterinary Community /Руководство по вакцинации собак и кошек/ М. Дж. Дэй, М. С. Хорзинек, Р. Д. Шульц, Р. А. Сквайерс, пер. с англ. под ред. д.в.н., проф. А.А. Сидорчука,2016, СС 29-40