удобно купить

211

10.11.2016

Изучение иммуногенной активности столбнячного компонента в составе ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота

Журнал «Ветеринария Кубани» №5, 2016 г.

Скляров О. Д. ФГБУ «ВГНКИ», г. Москва
Капустин А. В., Лаишевцев А. И., Гулюкин А.М ФГБНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко, г. Москва
Шемельков Е. В. ООО «Ветбиохим», г. Москва

Столбняк — это остро протекающая неконтагиозная инфекционная болезнь различных видов животных и человека.

Болезнь встречается во всех странах мира, но чаще в странах с теплым климатом, особенно в тропическом поясе [1, 3, 6, 8].

Возбудитель — Clostridium tetani — строгий анаэроб, представляющий собой тонкие грамположительные споросодержащие подвижные палочки размером 0,4-0,7*3-10 мкм [2, 7]. Споры образуются всегда на концах клеток, от чего они приобретают вид барабанных палочек. Споры длительно сохраняются в почве, представляя опасность для заражения восприимчивых животных [3, 5, 8].

Clostridium tetani — постоянный обитатель кишечника травоядных животных, откуда и попадает в почву, являющуюся основным источником заражения. Особенно много спор находят в земле огородов и садов, удобренной навозом. Инфицирование в основном происходит при случайных ранениях, переломах, укусах, тяжелых родах, а также хирургических операциях (кастрация, обезроживание, декапитация). После проникновения в поврежденные ткани, споры в анаэробных условиях прорастают и начинают размножаться, выделяя при этом два экзотоксина: тетаноспазмин, действующий на нервные клетки и вызывающий характерный для столбняка клинический синдром, и тетанолизин, вызывающий гемолиз эритроцитов. Каких-либо специфических изменений в ране при этом не возникает [6, 8].

Клиника столбняка обусловлена действием тетаноспазмина, который через кровь попадает в двигательные нервы, а затем спинной и продолговатый мозг. Токсин снимает тормозное влияние с вставочных нейронов, вследствие чего мышцы постоянно получают импульсы возбуждения, приходят в состояние ригидности, что проявляется периодическими клоническими судорогами. Затем наступает интоксикация центров продолговатого мозга, приводящая к угнетению дыхания, гипотензии, расстройствам сердечной деятельности. Все это приводит к глубокой гипоксии, биохимическим сдвигам в организме и ацидозу [6].

Инкубационный период длится от 2 до 60 дней, но обычно 7 — 10 дней. Болезнь протекает остро с повышением температуры до 41оС и выше и может проявляться в форме местного и общего столбняка, этиология и патогенез которых одинаковы.

Местный столбняк встречается редко и проявляется приступами тонических и клонических судорог только пораженной части тела. Прогноз при этом благоприятный.

Общий столбняк встречается чаще. Первым признаком при этом является сокращение жевательных мышц, сопровождающееся невозможностью открывать рот, жевать, глотать, произносить звуки. Почти одновременно с тризмом возникают мышечная ригидность шеи, спины, поясничной области.

По мере развития болезни возникает опистотонус, а затем тонические сокращения всех мышечных групп грудной клетки, живота, конечностей. Судороги мышц конечностей бывают настолько сильными и длительными, что могут приводить к разрывам мышц, переломам костей и вывихам в суставах. Спазм дыхательной мускулатуры и диафрагмы может вызвать остановку дыхания [6, 7, 8].

В случаях с благоприятным исходом через 2-3 недели начинается выздоровление. Сила судорог снижается, они становятся реже, нормализуется температура, уменьшается тризм, улучшается глотание. Исчезновение тонического напряжения мышц, как и появление, происходит сверху вниз. Первыми исчезают клонические судороги, затем гипертонус поперечно-полосатых мышц. Достаточно долго сохраняется скованность движений.

Диагноз ставят на основании характерных симптомов болезни: судорожное сокращение и ригидность мышц, вызываемая внешними раздражителями, а также лабораторными исследованиями патологического материала: экссудата из ран, гноя, кусочков ткани. Помимо выделения культуры Clostridium tetani большое значение имеет постановка биопробы на белых мышах, которым вводят экстракт материала. При наличии столбнячного токсина быстро проявляется клиника с характерной для столбняка картиной.

В случае неосложненного и остро протекающего столбняка патологоанатомические изменения во внутренних органах отсутствуют или выражены незначительно. Эта особенность ставит столбняк в особое положение среди острых токсикоинфекций.

Патологические изменения в паренхиматозных органах не удается обнаружить доже при экспериментальном заражении. Ряд авторов говорит о наличии полнокровия, атрофии и дегенеративных процессов в селезенке, печени, легких и особенно в почках [2, 7]. Хотя эти признаки могут быть связаны с интенсивной медикаментозной и сывороточной терапией, а не со столбнячной интоксикацией.

Наиболее характерными патологоанатомическими находками при столбняке являются переломы костей, особенно компрессионные переломы позвонков (тетанус-кифозы), разрывы мышц и сухожилий, резко выраженное и быстро наступающее трупное окоченение мышц.

В основе лечения столбняка лежит хирургическая обработка первичного очага инфекции, нейтрализация циркулирующего в крови тетанотоксина противостолбнячной сывороткой, противосудорожная терапия, длительное обеспечение вентиляции легких, уход и непрерывное наблюдение за больным.

Наиболее надежным способом предотвращения столбняка остается вакцинация. Единственным иммунобиологическим препаратом для профилактики столбняка животных является «Анатоксин столбнячный концентрированный», разработанный еще в 1954 году [2]. Препарат представляет собой инактивированный теплом и формалином токсин Cl.tetani, концентрированный путем сорбции алюмокалиевыми квасцами или гидратом окиси алюминия с последующей декантацией надосадка. Препарат имеет несомненное преимущество, так как индуцирует у животных образование иммунитета к столбняку после однократного введения сравнительно небольших доз (0,5 мл мелким животным и 1,0 мл крупным), с практически пожизненной продолжительностью. Однако это имеет и отрицательную сторону, так как, обладая высокой иммуногенностью, анатоксин плохо очищен от балластных веществ, что приводит к образованию значительных болезненных отеков на месте введения. Это не только снижает продуктивность сельскохозяйственных животных, но и сильно отражается на выставочных качествах и работоспособности, актуальных для спортивных и рабочих лошадей и других животных.

В настоящее время в связи с развитием интенсивного животноводства актуальным становится использование для иммунизации ассоциированных вакцин. Поскольку отечественных ассоциированных вакцин против клостридиозов крупного рогатого скота в Российской Федерации не разработано, была поставлена задача разработать такой препарат из наиболее актуальных видов клостридий. При этом возникла необходимость изучения обоснованности дозы компонента Cl.tetani в вакцине, степень напряженности иммунитета и его продолжительность при однократном и двукратном введении.

Материалы и методы. Для изучения иммуногенной активности столбнячного компонента в ассоциированной вакцине против клос-тридиозов крупного рогатого скота была использована экспериментальная серия № 1 препарата «Вакцина против клостридиозов овец и крупного рогатого скота ассоциированная инактивированная», «Анатоксин столбнячный концентрированный», стандартная антитоксическая противостолбнячная сыворотка, выпускаемая НЦЭСМП Минздрава России, белые мыши массой 16-20 г, шприцы стерильные, про-бирки микробиологические, чашки Петри, анаэростат, газогенераторные пакты для анаэробов, питательные среды Китта-Тароцци, Шедлера, Сабуро, МПА, МПБ [2, 4, 7].

Результаты исследования. Для проведения опыта по определению напряженности иммунитета в отношении компонента Cl.tetani, индуцируемого ассоциированной вакциной в сравнении с коммерческим столбнячным анатоксином, были сформированы 3 группы кроликов массой 2,0-2,5 кг по 8 голов в каждой.

Первой группе из восьми кроликов вводили ассоциированную вакцину подкожно двукратно с интервалом 28 суток в дозе 1 мл, при этом содержание столбнячного компонента в дозе составляло 0,1 мл. Кроликов второй группы иммунизировали «Анатоксином столбнячным концентрированным» в дозе 0,5 мл однократно согласно инструкции по применению, животных третьей группы использовали в качестве отрицательного контроля.

Через 14-18 суток после повторного введения ассоциированной вакцины у кроликов первой группы и через 25 дней после вакцинации у кроликов второй группы, а также у контрольных животных брали кровь, получали сыворотку и использовали её для определения титра антитоксических антител в реакции нейтрализации Cl. tetani на белых мышах.

Для постановки реакции нейтрализации токсин разводили до содержания 200 Dlm/см³ для белых мышей. Сыворотку крови животных каждой из опытных групп в равных объемах объединяли в общую

пробу, перемешивали и вносили в пробирки по 1,0 см³. В каждую пробирку с сыворотками добавляют по 1,0 см³ рабочего разведения токсина. Смесь токсин/сыворотка тщательно перемешивали, не допуская образования пузырьков воздуха, и выдерживали в течение 4560-ти минут при 37-38оС. Для определения нейтрализации имеющегося в смеси токсина антителами сыворотки крови вакцинированных животных, смесь вводили пяти белым мышам по 0,5 см³ подкожно в области задней конечности.

Для контроля активности токсина его разводили с таким расчетом, чтобы в 1 см³ содержалось 2 Dlm и вводили 5 белым мышам по 0,5 см&sup3, то есть каждая мышь получала 1 Dlm столбнячного токсина. Учёт результатов проводили через 72 часа после заражения.

Вакцину считали специфически эффективной, если после введения смеси в опытной группе выживало менее 4-х белых мышей из 5-ти, при гибели не менее 4-х из 5-ти белых мышей в контрольной группе. Результаты опыта представлены в таблице 1.

Таблица 1. Иммуногенная активность ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота в отношении компонента Cl. tetani

Группа животных

Доза препарата

Доза заражаю­щего токсина,
Dlm

Коли­чество заражен­ных животных

Коли­чество выжив­ших животных

Процент выжив­ших животных

1

Вакцинированы ассоциированной вакциной

1,0

100

5

5

100

1,0

2

Вакцинированы анатоксином

0,5

100

5

5

100

3

Контрольные

 

1

5

0

0

Как видно из представленных данных, оба препарата обеспечивали значительное накопление антитоксических антител к крови вакцинированных кроликов, что выявлялось полной нейтрализацией смеси и обеспечивало 100% выживаемость белых мышей, при этом гибель контрольных животных составила 100%. Для изучения продолжительности противостолбнячного иммунитета, вакцинированных и контрольных животных содержали в тех же условиях на протяжении 13-ти месяцев. Через каждые 30 дней у кроликов каждой группы брали образцы крови, получали сыворотки, которые объединяли в общую групповую пробу, использовали для постановки реакции нейтрализации на белых мышах по описанной схеме, отслеживая, таким образом, продолжительность индуцированного препаратами иммунитета. Результаты опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2. Продолжительность иммунитета у вакцинированных кроликов в реакции нейтрализации на белых мышах

Вакцина

Выживаемость иммунизированных и контрольных белых мышей в опыте по определения продолжительности иммунитета в реакции нейтрализации Cl. tetani

Срок, мес.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1

Ассоци­ирован­ная

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

55

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

2

Анаток­син

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

3

Контроль­ная группа

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

0/5

Как видно из представленных в таблице 2 данных, ассоциированная вакцина индуцирует у вакцинированных кроликов напряжённый иммунитет, позволяющий выдерживать заражение в дозе 100 Dlm. При этом выживаемость иммунизированных животных на протяжении всего срока наблюдения составляла 100%, что позволяет установить срок продолжительности иммунитета не менее 13-ти месяцев. Проводить исследование дальше для определения более точного срока не имело смысла, так как другие компоненты ассоциированной вакцины, в частности компонент Cl.chauvoei, обеспечивали иммунитет сроком не более 12-ти месяцев.

Полученные результаты позволяют считать обоснованным заложенную в препарат дозу компонента Cl. tetani 0,1 мл, а также установить продолжительность иммунитета против столбняка, вызываемого ассоциированной вакциной при двукратном введении — 12 месяцев.

Заключение. Проведенные опыты по изучению эффективности специфической профилактики столбняка путем иммунизаци и вакциной против клостридиозов ассоциированной инактивированной, показали, что двукратное введение препарата позволяет получить напряженный иммунитет у животных на срок не менее 12-ти месяцев. Результаты анализа применения вакцины позволяют рекомендовать «Вакцину против клостридиозов крупного рогатого скота инактивированную» для профилактической иммунизации животных против столбняка животных.

Список литературы:

  1. Гулюкин М. И. и др. Практическое пособие по мониторингу бруцеллеза, туберкулеза, паратуберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота: организационно-хозяйственные, ветеринарно-санитарные и зоогигиенические аспекты профилактики и ликвидации этих инфекций.// Москва, 2014 г. 74 стр.
  2. Елизаровский Г. И. Концентрированный столбнячный анатоксин. // Диссертация на соискание ученой степени доктора вет. наук. Архангельск, 1964 г. Стр. 226.
  3. Карганова-Мюллер Ф. С. Столбняк. // Москва, Наркомздрав СССР, Мед-гиз, 1940 г. Стр. 194.
  4. Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов, Москва, Мин. Здравохранения СССР, ГКИ биопрепаратов им. Л.А. Тарасевича. 1972 г. Стр. 227-230.
  5. Моторыгин А. В. Видовой состав клостридий крупного рогатого скота. //Вестник ветеринарии, №1 (64), 2013 г. Стр. 71-73.
  6. Поздеев О. К. Столбняк. Медицинская микробиология // Москва, 2010 г. Стр. 323-325.
  7. Скородумов Д. И. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. // Справочник, Москва, 2005 г. Стр. 344- 346.
  8. Сторожев ЛИ. Инфекционные болезни животных. // Справочник. Москва, 1987 г. Стр. 228- 229.
  9. David T. Cattle Disease Guide // 2001 Palo duro consultation Reseanch -Feedlot, P. 56.
  10. Olds R. J. A color Atlas of Microbiology. // Wolfe Med. Publ. 1986 г.
  11. Roger W. B. Color Atlas of diseases and disorders of cattle. // Second edition. USA, Columbia Missoure, 2003, pp. 204-206.

Резюме. Столбняк представляет важную проблему как гуманной, так и ветеринарной медицины, о чем свидетельствуют материалы ВОЗ и сообщения различных исследователей. Болезнь протекает, как правило, с явлениями тяжелой интоксикации и почти всегда заканчивается летально. Специфическая профилактика является единственным надежным способом профилактики болезни. Поскольку в РФ отсутствовали отечественные ассоциированные вакцины против анаэробных болезней крупного рогатого скота, была поставлена задача разработать ассоциированную вакцину против наиболее актуальных клостридио-зов, в том числе столбняка, и провести сравнительное изучение иммуногенной активности компонента Cl.tetani в ассоциированной вакцине в сравнении с существующим концентрированным столбнячным анатоксином. В ходе выполнения работы было произведено определение оптимального объёма анатоксина Cl. tetani, входящего в состав иммунизирующей дозы экспериментальной серии ассоциированной инактивированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота, равного 0,1 мл. При этом оба препарата смогли обеспечить значительное накопление антитоксических антител, что было подтверждено в реакции нейтрализации на белых мышах со стопроцентной выживаемостью, при гибели всех мышей контрольной группы. Лабораторные исследования на кроликах, используемых в качестве биологической модели, позволило определить продолжительность противостолбнячного иммунитета, который составил 13 месяцев с момента начала исследования. Необходимость в дальнейшей изучении данного показателя не имело обоснованности ввиду того, что срок остальных компонентов данной ассоциированной вакцины не превышает 12-ти месяцев. Полученные данные подтверждают возможность использования данного препарата к качестве средства специфической профилактики столбняка животных.