Использование метода иммуногистохимии при диагностике цирковирусных болезней свиней

Виктория Васильевна Стаффорд, старший научный сотрудник, fgnssbeq.i.i@tznvy.pbz

Яна Борисовна Стрельцова, аспирант, hzrfvab@bhgybbx.pbz

Сергей Алексеевич Раев, к.в.н., ведущий научный сотрудник, enrifretrl@znvy.eh

Антон Геннадьевич Южаков, к.в.н., ведущий научный сотрудник, nagba_bfxby@znvy.eh

Алексей Дмитриевич Забережный, д.б.н., профессор, заместитель директора по науке; nqzva@ivri.eh

Тарас Иванович Алипер, д.б.н., профессор, заведующий лабораторией 

ФГБНУ ФНЦ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН (109428, г. Москва, ул. Рязанский пр-т, д.24, к.1)

Цирковирусные болезни свиней (ЦВБС) – одна из актуальных проблем в промышленном свиноводстве. Возбудителем заболевания является цирковирус свиней 2 типа, повсеместно распространенный среди животных этого вида. В связи с отсутствием патогномоничных признаков болезни для постановки диагноза на ЦВБС используют лабораторные методы диагностики, в частности, иммуногистохимию  (ИГХ). В представленной работе приведены данные по разработке метода ИГХ для выявления капсидного белка ЦВС-2 в образцах патологического материала. В результате проведенной работы было показано, что данная методика позволяет установить взаимосвязь между наличием ЦВС-2 и проявлением патологии. 

В настоящее время цирковирусные болезни свиней (ЦВБС) считают одним из наиболее экономически значимых заболеваний в промышленном свиноводстве. ЦВБС включают следующие инфекции: синдром послеотъемного мультисистемного истощения (СПМИ), синдром дерматита и нефропатии свиней (СДНС), респираторные и репродуктивные нарушения свиней, а также субклиническую форму инфекции. В зависимости от вида ЦВБС клинические проявления возникают у поросят как на этапе доращивания, так и в откормочный период. Заболеваемость и летальность свиней в хозяйствах варьируют в широких пределах от 1 до 60% и от 1 до 100% соответственно [3, 4, 6].

Возбудитель ЦВБС – цирковирус свиней 2 типа (ЦВС-2) относится к роду Circovirus семейству Circoviridae. Вирионы ЦВС-2 представляют икосаэдрические частицы (32 капсомера, построенные из капсидного белка размером 233 аминокислоты) диаметром 16 – 21 нм. Вирус распространен по всему миру, включая Россию [1, 5, 14].

На вскрытии поросят с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения легкие тяжелые, спавшиеся, имеют каучукоподобную консистенцию. Лимфатические узлы гиперплазированы, кровенаполнены, желто-красного цвета. Может развиваться отек рыхлой соединительной ткани и увеличение паренхиматозных органов. Печень при данной патологии светлая, дряблой консистенции. Желчный пузырь переполнен густой темной желчью. Селезенка полнокровна. Почки с узелками белого цвета, кровоизлияния под капсулой, разрастание соединительной ткани [10].

При синдроме дерматита и нефропатии почки отечны, увеличены, плотные с кровоизлияниями, лимфатические узлы увеличены, темно-красного цвета. Инфицированные свиноматки часто рожают мертвых поросят, при вскрытии которых обнаруживают гипертрофию сердца и застойную гиперемию печени, а в миокарде участки некроза белого цвета [14].

Для лабораторной диагностики ЦВБС используют ряд методов, в том числе ИФА (для выявление иммуноглобулинов класса M и\или G), ПЦР, гибридизацию in situ, а также иммуногистохимию (ИГХ). Выявление последним капсидного белка ЦВС-2 в органах и тканях позволяет проводить дифференциальную диагностику вызываемых этим агентов синдромов от сходно протекающих болезней другой этиологии, например, репродуктивного и респираторного синдрома, болезни Ауески, гриппа, микоплазмоза, актинобациллеза, бордетеллиоза, актинобациллеза [3, 4, 8, 9, 11, 13]. Это делает ИГХ анализ полезным инструментом для ежедневной работы ветеринарных специалистов в диагностических лабораториях и патоморфологов [7]. 

Цель исследования – разработка и применение прямого иммуногистохимического метода при диагностике ЦВБС.

Материалы и методы. Патоморфологический и иммуногистохимический анализ выполняли в секторе патоморфологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН. Материалом для исследований служили пробы трахеи, почек, сердца, селезенки, пораженных участков верхушечной и добавочной долей легких, лимфатические узлы свиней из хозяйства РФ, в котором установлена циркуляция ЦВС-2, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, Mycoplasma hyopneumoniae и ряда других респираторных патогенов. Патологический материал фиксировали 24 – 72 ч при комнатной температуре в 10%-ном растворе забуференного нейтрального формалина. В случае отсутствия фиксатора пробы органов доставляли в лабораторию в замороженном виде. Для длительного хранения материала использовали низкотемпературные холодильники с температурой минус 60 ⁰С.

Образцы органов фиксировали на специальных столиках для криотомной резки гелем Neg-50, формируя удобный для нарезания блок. После полного промерзания при температуре минус 34 ⁰С из блоков получали срезы толщиной 5 мкм. Их прикрепляли к поляризированным стеклам или стеклам с адгезивным покрытием. Для использования нескольких гистотехнических методик (рутинное окрашивание, ИГХ реакция) из одного образца патологического материала готовили срезы для необходимого количества стекол. Часть из них окрашивали гематоксилин-эозином для обнаружения патоморфологических изменений;  другую часть – 

для выявления капсидного белока ЦВС-2.

Перед проведением ИГХА полученные срезы выдерживали в смеси изопропилового спирта с физиологическим раствором при 4 ⁰С – 60 минут. Далее их 3 раза по 3 – 5 минут промывали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) (pH 7,6) при комнатной температуре. Для блокировки эндогенной пероксидазы на срезы наносили 3%-ный раствор перекиси водорода, инкубировали 40 мин в термостате при 37 ⁰С и ополаскивали в ФСБ как описано выше. В качестве блокирующего компонента использовали 5%-ный раствор обезжиренного сухого молока в ФСБ (рН 7,6) и 40 мин инкубировали при 37 ⁰С. После этого срезы вновь промывали в ФСБ 3 раза по 3 – 5 минут при комнатной температуре. Далее их инкубировали 80 мин во влажной камере при 37 ⁰С с 200 мкл предварительно подобранного разведения ФСБ (рН 7,6) конъюгата моноклональных антител 6h12 с пероксидазой хрена (предоставлен АНО «НИИ ДПБ») [2]. После чего срезы промывали в ФСБ при комнатной температуре, наносили рабочий раствор хромогена (диметилформамид и 3-амино-9-этилкарбазол) на 0,02М Na-фосфатном буфере pH 5,0 в объеме 200 мкл и помещали во влажную камеру термостата на 30 мин при 37 ⁰С. Для прекращения реакции срезы аккуратно промывали в 3 этапа (каждый по 3 – 5 минут): первый – в дистиллированной воде; два последующих – в ФСБ. Далее, для лучшей визуализации клеток, срезы докрашивали гематоксилином Майера 5 – 10 минут с последующей отмывкой излишков краски дистиллированной водой и помещали на них монтирующую среду и покровные стекла. 

Результаты исследований и обсуждение. Криотомная методика при ее применении позволила нам выполнить гистологическое исследование и ИГХ реакцию на нативном материале в течение 1 – 2 дней и минимизировать затраты на гистотехническую обработку патологического материала. 

Стандартный метод окраски (гематоксилин-эозином) выявил в легких свиней с респираторной патологией следующие патологические изменения (рис. 1): разрыв стенок альвеол, утолщение висцерального листка легочной плевры и пропитывание его клетками лимфоидного ряда. В просвете альвеол наблюдали выпот однородного по структуре эозинофильного содержимого и лимфоциты. Разрыв стенок альвеол сопровождался развитием стеноза просвета близлежащих респираторных структур. В лимфатических узлах (рис. 2) обнаружили участки кровоизлияний, нарушение гистоархитектоники лимфатических фолликулов, характеризующееся изменениями их границ, местами – слияние структурных элементов двух и более фолликулов. У сохранившихся лимфатических фолликулов (рис. 2, 1) наблюдали нарушение структуры клеточных границ, разжижжение клеточного состава центральной части фолликулов. В местах слияния фолликулов наблюдали некротические изменения стромы и паренхимы органа с диффузно расположенными клетками лимфоидного типа. 

В трахее выявили воспалительный процесс, некроз структурных элементов, отеки различной локализации; в почках – участки кровоизлияния и некроза эпителия канальцев; в сердце – кардиомиопатию, фибринозные отложения на перикарде; в селезенки – очаги некроза, нарушение гистоархитектоники лимфоидных фолликулов, гиперемию с периваскулярным отеком стромы, скопление в паренхиме большого количества зернистых эозинофилов.

Методом ИГХ  (при оптимальных условиях его проведения) в легких (рис. 3) и лимфатических узлах (рис. 4) поросят с выраженной респираторной патологией, обнаружили характерно окрашенные конгломераты красно-коричневого цвета. При изучении срезов органов, полученных от поросят без респираторной патологии, характерного окрашивания не наблюдали (данные не представлены). Также получили отрицательные результаты ИГХА при исследовании срезов образцов почек, селезенки, трахеи, сердца.

Развитие респираторной патологии, ассоциированной с ЦВС-2 или другими возбудителями, не всегда сопровождается характерными клиническими и/или патологоанатомическими изменениями. Кроме того, нередко респираторные болезни свиней имеют смешанную этиологию [13]. Поэтому при проведении диагностических исследований необходимо, с одной стороны – определить количество первичных возбудителей комплекса респираторных болезней, с другой – установить ведущего патогена. 

В ходе выполнения исследований нами выявлены патологоанатомические изменения, указывающие на полиэтиологический характер респираторной патологии свиней. Воспалительные и дегенеративные процессы в разных паренхиматозных органах  (селезенка, трахея, почки, сердце, лимфатические узлы, легкие) негативно отразились на их функциональном состоянии и создали необходимые условия для размножения бактериальных патогенов. 

Использование криотомной методики, позволило нам выполнить гистологические исследования и ИГХА нативного материала в течение 1 – 2 дней и минимизировать затраты химических реактивов. Высокую специфичность ИГХА обеспечило применение моноклональных антител к капсидному белку ЦВС-2. 

В большинстве препаратов легких и лимфатических узлов свиней с респираторной патологией наряду с обширными воспалительными изменениями обнаружили капсидный белок ЦВС-2. Таким образом, можно сделать вывод о том, что ЦВС-2 является, по крайней мере, одним из ведущих патогенов респираторной патологии животных на данном свинокомплексе. Напротив, в почках, селезенке, трахее и сердце тех же свиней, а также в легких и лимфатических узлах клинически здоровых поросят выявить антиген не удалось. Первое свидетельствует, как минимум, о низкой вирусной нагрузке в исследуемом материале, а второе – подтверждает специфичность показаний ИГХА. Ранее также сообщалось о зависимости уровня концентрации ЦВС-2 в тканях и характера полученных в ИГХА результатов [12]. Для окончательного определения минимальной концентрации ЦВС-2, которую способен улавливать данный метод, а также для использования не только качественной, но и количественной оценки его результатов, необходимо проведение дополнительных исследований. 

Заключение. Обобщая данные, полученные при проведении патоморфологического и иммуногистохимического исследований, можно сделать вывод, что патологических изменения в легких и лимфатических узлах ассоциированы с наличием ЦВС-2, а изменения, выявленные в других паренхиматозных органах, обусловлены влиянием других патогенов. Разработанная методика ИГХА может быть использована как в диагностических исследованиях, так и при оценке эффективности вакцин против ЦВБС-2. 

Работа выполнена в рамках утверждённого плана НИР ФГБУ ФНЦ ВИЭВ РАН на 2019 – 2021 гг.

Литература

1. Булгаков А. Д., Гребенникова Т. В., Южаков А. Г. и др. Молекулярно-генетический анализ геномов вирусов репродуктивного и респираторного синдрома свиней и цирковируса свиней второго типа, циркулирующих на территории Российской Федерации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2014; 4:29 – 33.
2. Козлов А. Ю., Костина Л. В., Алексеев К. П. и др. Получение моноклональных антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) и их применение для диагностики цирковирусной инфекции. Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2013; 2:20 – 22.
3. Орлянкин Б. Г. Цирковирусные болезни свиней: распространение, диагностика и специфическая профилактика. Ветеринария. 2013; 8:3 – 9.
4. Раев С. А., Орлянкин Б. Г., Мишин А. М., Забережный А. Д., Верховский О. А., Гребенникова Т. В., Алексеев К. П., Мусиенко М. И., Алипер Т. И. Цирковирусные болезни свиней. Методические рекомендации по диагностике и специфической профилактике. Москва, 2017.
5. Раев С. А., Южаков А. Г., Мишин А. М., Алипер Т. И., Распространение и филогенетический анализ циркулирующих в России штаммов цирковируса свиней второго типа и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Материалы VII научно-практической конференции «Ветеринария в свиноводстве 2018». Новосибирск, 70. 
6. Семенцов В. И., Васильев А. К., Пруцаков С. В., Болоцкий И. А. Цирковирусные болезни свиней (ЦВБС). Ветеринария кубани. 2009; 5:8 – 10.
7. Семченко В. В., Барашкова С. А., Артемьев В. Н. Гистологическая техника. Омск – Орел: Омская областная типография, 2006. 
8. Стаффорд В. В., Корицкая М. А., Раев С. А., и др. Иммуногистохимическая диагностика репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Методические рекомендации, 2017.
9. Стаффорд В. В., Забережный А. Д., Гулюкин М. И. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома и цирковирусом свиней типа 2. Ветеринария. 2016; 9:24 – 27. 
10. Clark E. Post-weaning multisystemic wasting syndrome. Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 1997; 28:499 – 501. 
11. Opriessnig T., Halbur P. G., Meng X. J. Porcine Circovirus Type 2–Associated Disease: Update on Current Terminology, Clinical Manifestations, Pathogenesis, Diagnosis, and Intervention Strategies. J. Vet. Diagn. Invest. 2007; 19:591 – 615.
12. Opriessnig T., Thacker E. L., Yu S. et al. Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus type 2.Vet Pathol. 2004; 41 (6):624 – 640.
13. Opriessnig T., Gime´nez-Lirola L. G., Halbur P. G. Polymicrobial respiratory disease in pigs. Animal Health Research Reviews. 2011; 12 (2):133 – 148. 
14. Segales J. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: clinical signs, pathology and laboratory diagnosis. Virus Res. 2012; 164:10 – 19.