удобно купить

1542

22.06.2018

Разработка и оценка эффективности живой маркированной вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» против болезни Ауески

Журнал "Ветеринария" №6 2018

Евгений Владимирович Шемельков к.в.н., начальник отдела, furzryxbi@znvy.eh

Александр Павлович Котельников, к.в.н., председатель координационного совета

Татьяна Сергеевна Куликова сотрудник отдела

ООО «Ветбиохим»

Александр Михайлович Мишин, к.в.н., консультант

Олег Анатольевич Верховский, д.б.н., профессор, президент

АНО «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных»

Тарас Иванович Алипер, д.в.н., профессор, генеральный директор

НПО «НАРВАК»

 

В статье представлены результаты разработки и оценки эффективности оригинальной живой маркированной вакцины против болезни Ауески. Основным ее компонентом является вирус со стабильной делецией гена, кодирующего один из структурных белков вириона – гликопротеин gE, и накапливающийся в перевиваемой культуре клеток СПЭВ в высоком титре. Генетическая стабильность делеции гена подтверждена методами ПЦР в режиме реального времени и ИФА. Установлено, что оптимальное содержание вируса в лиофилизированном препарате должно составлять 5,0 lg ТЦД50/см3. Вакцина вызвала у свиней сероконверсию – титр вируснейтрализующих антител был выше, чем у животных, иммунизированных зарубежными аналогами и немаркированной вакциной на 23,2 – 29,3 % <0,05). Доказана безвредность препарата для свиней всех возрастных групп. Показано отсутствие горизонтальной передачи вакцинного маркированного вируса при совместном содержании иммунных и неиммунных животных. У свиноматок не зарегистрировали поствакцинальных осложнений в период супоростности, случаев абортов и снижения производственных показателей. Иммунизированных маркированной вакциной свиней можно дифференцировать от естественно инфицированных по антительному ответу в ИФА. Это делает возможным внедрение стратегии DIVA для проведения профилактических и оздоровительных мероприятий в промышленном свиноводстве. Разработанный препарат получил коммерческое название «ВЕРРЕС-БАgE-», а специальный растворитель для него – «ВЕРРЕС-SOLVENT». Ключевые слова: болезнь Ауески, вирус, антитела, растворитель, маркер, антигенная активность, безвредность.

Live marker vaccine against Aujeszky's disease «VERRES-BAgE»: development and evaluation of efficiency

Y.V. Shemelkov, A.P. Kotelnikov, T.S. Koulikova,

Vetbiochem

 A.M. Mishin, O.A. Verkhovsky

Institute for Diagnosis and Prevention of Human and Animal diseases

T.I. Aliper

Narvac

The present article summarizes the results obtained upon the development and evaluation of efficiency new live marker vaccine against Aujeszky’s disease. A virus carrying a stable deletion of the gene encoding glycoprotein gE, one of the virion's structural proteins, was used as the active component of the vaccine. High titres of the vaccine virus could consistently be obtained in pig embryo kidney passaged cell culture (SPEV). Genetic stability of the deletion was confirmed by PCR-RT and ELISA. It was established that the infectious dose of the virus in a freeze-dried product should correspond to 5,0 lg TCID50/cm3. When administered to pigs, the vaccine triggered off pronounced seroconversion, with antibody levels exceeding those measured upon administration of a similar product manufactured overseas or of a traditional vaccine by 23,2 to 29,3% <0,05). The vaccine was proven to be safe for animals of all groups. It was shown the absence of the horizontal transmission vaccine virus between immunized and non-immunized animals kept together. Vaccinated sows did not display any complications during pregnancy, and no cases of abortions or declining productivity were recorded. It’s possible to differentiate vaccinated and infected animals by antibodies response in ELISA. The DIVA strategy could therefore be implemented in industrial pig breeding for prophylactic and control of Aujeszky’s disease. The product was named «VERRES-BAgE» and special diluent for it – «VERRES-SOLVENT». Key words: Aujeszky’s disease, virus, antibody, diluent, marker, antigenic activity, safety.

Болезнь Ауески (БА) – острая вирусная инфекция, протекающая в виде эпизоотии или спорадических случаев. К ней восприимчивы многие виды домашних и диких млекопитающих. Характеризуется признаками поражения головного и спинного мозга, легких, сильным зудом и расчесами всех видов животных кроме свиней), а также септицемией. Наносит свиноводству значительный экономический ущерб, обусловленный большим отходом молодняка, низкой эффективностью откорма и непригодностью использования для племенного разведения выживших животных. Заражение свиноматок приводит к резкому нарушению воспроизводства стада из-за абортов и рождения неполноценных поросят. Вирус часто является первичной причиной пневмонии свиней [1, 2, 6, 7].

Возбудителем БА является ДНК-содержащий вирус из рода Varicellovirus семейства Herpesviridae, вызывающий характерное цитопатогенное действие при культивировании в первичных и перевиваемых культурах клеток. Патоген относится к пантропным, хотя склонен к нейро- и пневмотропизму, кроме того он способен поражать клетки иммунной системы, вызывая иммунодефицитное состояние [6, 7]. У переболевших свиней БА переходит в латентную форму, при которой возбудитель может пожизненно персистировать в клетках центральной нервной системы, миндалин и лимфатических узлов. Его геном интегрируется в ДНК клетки хозяина и при определенных обстоятельствах он реактивируется и инициирует новый цикл размножения агента, провоцируя возникновение заболевания и выделение вируса во внешнюю среду, что сопровождается заражением восприимчивых животных. Провоцирующим фактором, в данном случае выступают различные стрессовые ситуации [2, 5].

Диагностика БА направлена на обнаружение антигена или ДНК вируса, выделение возбудителя в культуре клеток, а также выявление инфицированных животных серологическими методами, среди которых основным и утвержденным OIE является иммуноферментный анализ (ИФА) [2, 4, 11].

До появления маркированных вакцин специфическая профилактика БА базировалась на применении инактивированных или живых аттенуированных вакцин, обладающих своими достоинствами и недостатками [2, 3]. С их помощью удается существенно снизить инфекционный фон и сократить экономические потери от заболевания, но они не решают проблему инфицирования поголовья и распространения вируса среди свиней. Эффективно и экономически целесообразно ликвидировать БА можно лишь сочетанием вакцинации, диагностики и выбраковки инфицированных животных [2].

В настоящее время в мире широко используются две стратегии искоренения БА. Первая предусматривает полное отсутствие вакцинации и постоянный серомониторинг с последующей выбраковкой положительно реагирующих животных. Вторая, основанная на стратегии DIVA (от англ. Differentiating Infected from Vaccinated Animalsдифференциация инфицированных и вакцинированных животных), реализуется применением маркированных вакцин. Вирусы, из которых изготавливают такие вакцины, должны иметь генетические и, соответственно, антигенные отличия от полевых штаммов возбудителя, которые легко установить серологическими методами. Как правило, с этой целью используют вакцинный вирус, маркированный по гликопротеину gE. В последующем иммунизированных им животных легко отличить от естественно инфицированных по отсутствию антител к гликопротеину gE при наличии антител к другому гликопротеину (gВ) вируса БА или специфических вируснейтрализующих антител. Серопозитивных к гликопротеину gE свиней выбраковывают как естественно инфицированных [2, 3, 6]. Несмотря на то, что в настоящее время многие страны свободны от БА или контролируют ее посредством стратегии DIVA, не исключены случаи появления новых высоко патогенных штаммов возбудителя болезни. К примеру, в 2012 – 2013 гг. подобная вспышка БА произошла в южных регионах Китая, следствием ее стали значительные экономические потери [9]. Кроме того, существует достаточно активная циркуляция возбудителя БА в популяции дикой фауны, что способствует поддержанию природного резервуара инфекции [6].

В нашей стране вакцинация против БА является обязательной, для чего используют широкий спектр отечественных и зарубежных препаратов, в том числе и немаркированных, после применения которых невозможно дифференцировать поствакцинальный иммунный ответ от постинфекционного [1, 3, 8].

Цель работы – создание живой маркированной вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» против БА, изучение иммунобиологических свойств препарата и оценка в лабораторных и производственных условиях эффективности его применения.

Материалы и методы. Для разработки вакцины использовали штамм «Скиф» вируса БА, ранее полученный коллективом авторов во главе с профессором В.А. Сергеевым [6]. Данный штамм имеет генетически стабильную делецию гена, кодирующего один из структурных белков вириона – гликопротеин gE (БАgE-). Вирус накапливали в перевиваемой культуре клеток СПЭВ. Инфекционную активность штамма БАgE- определяли титрованием в соответствующей клеточной культуре по стандартной методике. Его накопление оценивали по цитопатическому действию, инфекционный титр вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3. Наличие делеции в гене вируса контролировали методом ПЦР в режиме реального времени [10].

Полученную вируссодержащую суспензию лиофилизировали с добавлением защитной среды высушивания.

В качестве растворителя использовали специально разработанный препарат на основе сополимеров полиакриловой кислоты – «ВЕРРЕС-SOLVENT».

Оптимальную иммунизирующую дозу испытуемой вакцины определили в эксперименте, проведенном на не иммунных поросятах 3-месячного возраста. Для этого по принципу аналогов сформировали 5 групп (n=5 в каждой). Животным каждой группы внутримышечно ввели одно из разведений вакцины, содержащих в прививной дозе 1 см3) 3, 4, 5, 6 или 7 lg ТЦД50 вируса. Через 21 сутки поросят повторно вакцинировали в тех же дозах. Для серологических исследований до и через 21 сутки после первой и второй иммунизаций от подопытных животных брали пробы сыворотки крови для определения титра вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации (РН), а также относительное содержание специфических антител к гликопротеинам gВ и gЕ вируса БА иммуноферментным методом (ИФА). РН ставили микрометодом по общепринятой методике. За титр вируснейтрализующих антител принимали наибольшее разведение сыворотки крови, которое сдерживало ЦПД вируса в 50 % зараженных культур клеток. Для выявления антител в ИФА использовали соответствующие коммерческие наборы (ООО «Ветбиохим», Россия). Постановку реакции, учет и интерпретацию полученных в ней результатов проводили согласно наставлениям по применению. Маркером вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» служило наличие в сыворотке крови вируснейтрализующих и/или антител к gВ на фоне отсутствия антител к gE вируса БА.

В следующем опыте, поставленном на серонегативных поросятах 2-месячного возраста, определяли безвредность, антигенную активность, наличие маркера и возможность горизонтальной передачи вируса БА. Для этого использовали 4 группы животных. Поросят первой и второй групп (n =10 в каждой) иммунизировали вакциной «ВЕРРЕС-БАgE-» в прививной дозе 5 lg ТЦД50/см3. При этом сухую вакцину для иммунизации животных первой группы разводили растворителем «ВЕРРЕС-SOLVENT», а второй группы – физиологическим раствором. Животных вакцинировали внутримышечно двукратно интервалом 21 сутки). В качестве отрицательного контроля в каждой группе использовали двух неиммунных поросят, содержащихся в одном боксе с вакцинированными животными. Они служили индикатором возможной горизонтальной передачи вируса от вакцинированных особей. Молодняк третьей группы (n=7) иммунизировали инактивированной концентрированной эмульгированной немаркированной вакциной БАК, а четвертой (n=7) – зарубежной живой маркированной вакциной, содержащей штамм вируса БА с делецией гена, кодирующего gE. Коммерческие препараты вводили в дозах, рекомендованных в инструкциях по их применению, двукратно с интервалом 21 сутки. Всех использованных в опыте животных идентифицировали индивидуальными магнитными чипами. В течение 10 суток после каждой вакцинации у всех животных ректально измеряли температуру тела, наблюдали за их общим клиническим состоянием и реакцией в месте инъекции препаратов. Пробы крови для серологического исследования в РН и ИФА брали у них до и через 21 сутки после первой и второй иммунизаций.

Для оценки антигенной активности вакцины в условиях свиноводческого хозяйства сформировали по принципу аналогов 4 группы не иммунных поросят 2 – 3-месячного возраста. Животным первой группы (n=118) ввели вакцину «ВЕРРЕС-БАgE-» с растворителем «ВЕРРЕС-SOLVENT»; второй (n=119) – ту же вакцину, но растворяли ее в физиологическом растворе. Молодняк третьей группы (n=24) иммунизировали вакциной БАК; а четвертой (n = 10) – служил отрицательным контролем. Дозы вводимых препаратов и дальнейшая схема опыта были такими же, как в предыдущем эксперименте.

Безвредность вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» с растворителем «ВЕРРЕС-SOLVENT» оценили на ремонтных свиноматках (n=21), которых дважды с интервалом 28 суток вакцинировали препаратом в двукратной дозе (2 см3) с инфекционной активностью 5 lg ТЦД50/см3. Безвредность вакцины для животных оценивали по отсутствию существенных изменений температуры тела, общей реакции на введение препарата и реакции в месте ее инъекции. Наблюдение за ремонтными свиноматками вели в течение 14 суток.

Влияние вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» с растворителем «ВЕРРЕС-SOLVENT» на течение супоросности свиноматок и изучение тератогенного действия препарата оценивали в опыте на супоросных свиноматках (n=32). Животных вакцинировали внутримышечно в прививной дозе 5 lg ТЦД50/см3 двукратно с интервалом 21 сутки (не позднее, чем за 4 недели до опроса). За иммунизированными свиноматками наблюдали в течение всего срока супоросности. Критериями безвредности препарата для этой группы животных служили отсутствие абортов и врожденных уродств у молодняка, полученного от вакцинированных свиноматок, а также количество жизнеспособных поросят в помете.

Полученные данные статистически обрабатывали общепринятыми методами с использованием программ Microsoft Office Excel 2010, Stat Plus 2009.

Результаты исследований и обсуждение. На первом этапе работы установили, что введение разработанной вакцины в разных дозах стимулирует формирование гуморального иммунного ответа уже после первой инъекции, но уровень специфических антител зависит от инфекционного активности вируса (табл. 1, рис. 1). В этом же эксперименте подтвердили сохранение делеции гена, кодирующего синтез gE, маркированным вирусом независимо от его концентрации и проводимых манипуляций (табл. 1).

Таблица 1

Антигенная активность маркированного вируса БА

Инфекционная доза вируса, lg ТЦД50/см3

№№ свиней

Наличие антител в сыворотке крови к

Наличие маркера

 

 

до вакцинации

после 1-й вакцинации

после 2-й вакцинации

 

 gВ

 gЕ

 gВ

 gЕ

 gВ

 gЕ

3,0

1

+

+

 

 

2

+

+

 

3

+

+

+

 

4

+

+

 

5

+

+

4,0

1

+

+

+

 

 

2

+

+

 

3

+

+

+

 

4

+

+

+

 

5

+

+

+

5,0

1

+

+

+

 

 

2

+

+

+

 

3

+

+

+

 

4

+

+

+

 

5

+

+

+

6,0

1

+

+

+

 

 

2

+

+

+

 

3

+

+

+

 

4

+

+

+

 

5

+

+

+

7,0

1

+

+

+

 

 

2

+

+

+

 

3

+

+

+

 

4

+

+

+

 

5

+

+

+

Полученные результаты показали, что наименьшая доза вируса, обеспечивающая после первой иммунизации синтез антител к гликопротеину gВ и высокий уровень вируснейтрализующих антител у 100 % животных, составляет 5 lg ТЦД50. На этом основании ее стали считать оптимальной (прививной) для вакцинации свиней. Следует отметить, что поросята, которым инокулировали вирус в дозах 6 и 7 lg ТЦД50 (соответственно в 10 и в 100 раз превышавших оптимальную), оставались клинически здоровыми на протяжении всего эксперимента.

В следующем опыте по оценке иммунобиологических показателей вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» все иммунизированные поросята также оставались здоровыми в течение всего срока наблюдения. У отдельных животных в месте инъекции появлялись безболезненные, ограниченные, спонтанно проходящие припухлости. В некоторых случях у поросят регистрировали повышение температуры тела на 0,5 – 1,0 0С в первые 5 суток после иммунизации независимо от типа введенной вакцины против БА. Результаты исследований по определению антигенной активности вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» приведены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Антигенная активность разных типов вакцин против БА

Группа

Количество голов

Наличие антител*

Наличие маркера*

до вакцинации

после 1-й вакцинации

после 2-й вакцинации

Первая

10

+

+

+

Вторая

10

+

+

+

Третья

7

+

+

+

+

Четвертая

7

+

+

+

Пятая (не вакцинированные животные первой и второй групп)

4

*Поскольку результаты были идентичны у всех поросят внутри каждой группы, то приведены обобщенные данные по ним.

Таблица 3

Титр вируснейтрализующих антител у животных, иммунизированных разными типами вакцин против БА

Группа

Количество голов

Титр антител к вирусу БА*

до вакцинации

после 1-й вакцинации

после 2-й вакцинации

Первая

10

< 2

51

181

Вторая

10

< 2

55

137

Третья

7

< 2

49

128

Четвертая

7

< 2

45

139

Пятая (не вакцинированные животные первой и второй групп)

4

< 2

< 2

< 2

* Приведены средние геометрические значения титра антител в сыворотке крови животных соответствующих групп, выраженные в обратных величинах.

Анализ результатов, приведенных в таблицах 2 и 3, показывает, что вакцина «ВЕРРЕС-БАgE-» вызвала у поросят выраженную сероконверсию. При этом уровень вируснейтрализующих антител при использовании растворителя «ВЕРРЕС-SOLVENT» был на 24,3 % выше, чем при растворении препарата физиологическим раствором. Аналогично поросята, иммунизированные разработанным препаратом, по титру специфических антител в сыворотке крови превосходили на 23,2 – 29,3 % <0,05) животных, иммунизированных зарубежным аналогом или вакциной БАК. Серологические исследования подтвердили наличие маркера по гликопротеину gE у вакцинного вируса БА в препарате «ВЕРРЕС-БАgE-». Кроме того, у не иммунных свиней, содержащихся совместно с вакцинированными, не выявили в РН или ИФА антител к вирусу БА, что свидетельствует об отсутствии горизонтальной передачи вакцинного штамма. Дополнительным подтверждением этого стало отсутствие лихорадки у не вакцинированных поросят в течение всего срока наблюдения.

Результаты эксперимента, проведенного в свиноводческом хозяйстве, подтвердили более высокие иммунобиологические показатели вакцины «ВЕРРЕС-БАgE-» в сочетании с растворителем «ВЕРРЕС-SOLVEN» по сравнению с другими препаратами (табл. 4).

При оценке безвредности разработанной вакцины отмечали незначительное повышение температуры тела (на 0,5 – 1,0 0С) у ремонтных свиноматок в первые 5 суток после введения двукратной дозы препарата. У отдельных особей наблюдали вялость и небольшую быстропроходящую безболезненную гиперемированную припухлость в месте инъекции. Отказа от корма, изменений поведения и каких-либо еще поствакцинальных осложнений у иммунизированных свиней не регистрировали.

Двукратное введение разработанной вакцины с растворителем в рекомендованной дозе не вызвало у супоросных свиноматок абортов в последний триместр супоросности и других осложнений течения беременности, а также снижения производственных показателей (табл. 4).

Таблица 4

Плодовитость вакцинированных и контрольных свиноматок

Группа свиноматок

Количество свиноматок

Получено поросят

Средний выход поросят

Вакцинированные

32

279

8,72

Контрольные

32

274

8,56

 

Заключение. Результаты проведенных экспериментов показали, что разработанная отечественная живая маркированная вакцина против БА «ВЕРРЕС-БАgE-» обладает выраженной антигенной активностью, безопасна для всех групп свиней, включая поросят и супоросных свиноматок. Использование специального растворителя «ВЕРРЕС-SOLVENT» значительно повышает уровень поствакцинальных вируснейтрализующих антител.

Вакцинный штамм вируса БА не передается горизонтально при совместном содержании иммунизированных и интактных животных. Он имеет генетическую делецию гена, кодирующего гликопротеин gE, – ее стабильность подтверждена методами ПЦР в режиме реального времени и ИФА. По данному маркеру легко отличить иммунизированных вакциной «ВЕРРЕС-БАgE-» свиней от естественно инфицированных вирусом БА. Благодаря этому возможно внедрение стратегии DIVA для проведения профилактических и оздоровительных мероприятий в промышленном свиноводстве. Указанная стратегия может стать основополагающим элементом в разработке отечественной программы по искоренению болезни Ауески.

Литература

  1. Баборенко Е. П. Изучение поствакцинального иммунитета при использовании вакцин против вируса болезни Ауески свиней из маркированного штамма. Ветеринария сегодня. 2016; 4:49 – 52.
  2. Верховский О. А., Орлянкин Б.Г Болезнь Ауески. Диагностика и профилактика актуальных инфекционных и паразитарных болезней свиней. М., 2013; 37 – 39.
  3. Кукушкин С. А., Малов Д. В., Оковытая Т. В. Основы контроля и искоренения болезни Ауески в свинокомплексах России. Ветеринария. 2015; 4:13 – 18.
  4. Львов Д. К. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных/-М.: Медицинское информационное агентство, 2013; 848 – 850.
  5. Чернов А. Н. Особенности эпизоотической ситуации и оценка эффективности вакцинопрофилактики при болезни Ауески. Ученые записки Казанской ГАВМ им. Н.Э. Баумана. 2013; 213:314 – 318.
  6. Сергеев В. А., Непоклонов Е. А., Алипер Т. И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007; 309 – 312.
  7. Сюрин В. Н., Самуйленко А. Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных. М.: ВНИИТИБП, 1998; 603 – 630.
  8. Dong B., Zarlenga D. S., Ren X. An overview of live attenuated recombinant pseudorabies viruses for use as novel vaccines. J. Immunol. Res. Published online 2014; Jun 5.
  9. Gu Z., Hou C., Sun H., Yang W. et al. Emergence of highly virulent pseudorabies virus in southern China. Can. J. Vet. Res. 2015; 79 (3):221 – 228.
  10. Ma W., Lager K. M., Richt J. A.et al. Development of real-time polymerase chain reaction assays for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies and gene-deleted vaccine viruses Stoffregen. J. Vet. Diagn. Invest. 2008; 20 (4):440 – 447.
  11. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals chapter